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PTSD大鼠海马神经元凋亡变化及规律
PTSD大鼠海马神经元凋亡变化及规律 摘要:文章研究目的:观察创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马神经元凋亡的变化。方法:将成年Wistar大鼠20只分为对照组(n=10)和实验组(n=10),适应性饲养两周后,采用改良的单一连续应激方法(SPSS)制备PTSD大鼠模型,TUNEL方法检测海马神经元凋亡变化。结果:PTSD大鼠海马神经元的凋亡率高于对照组。结论:海马区神经元的凋亡与PTSD的发病有关
关键词:PTSD大鼠模型;海马神经元;神经元凋亡;TUNEL;病理改变 文献标识码:A
中图分类号:R749 文章编号:1009-2374(2017)06-0083-02 DOI:10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.06.042
创伤后应激障碍(Posttraumatic Stress Disorder,PTSD)是由异常心理创伤导致的延迟出现的持续性精神障碍,是一种对创伤因素的异常精神反应,近年来其病率越来越高,给社会带来了严重的经济负担。研究表明,PTSD患者出?F海马萎缩、体积缩小现象,其机制尚未阐明。我们推测海马神经细胞凋亡可能是导致这种现象的原因之一,本研究给予大鼠SPSS应激建立PTSD模型,利用TUNEL方法检测PTSD发病中海马神经元的凋亡情况,从而揭示创伤后应激障碍发病时海马区结构及功能发生异常的原因,为研究创伤后应激障碍的发病机制提供有效的实验依据
1 动物
体重为23±20g的健康雄性Wistar大鼠20只,购于华北理工大学实验动物中心,实验动物合格证号:SCXK 京2009-0004
2 主要试剂及仪器
TUNEL-POD细胞凋亡检测试剂盒购于上海七海复泰生物科技有限公司,-20℃保存。DAB显色液购于中杉金桥生物技术有限公司,4℃保存。组织包埋机、石蜡切片机、光学显微镜、防脱拨片、PBS缓冲液
3 实验方法
3.1 动物分组及模型建立
动物喂养于华北理工大学实验动物中心,适应性饲养两周后(温度22℃~25℃、噪声≤60dB、自由饮水摄食,12h白昼12h黑夜自然光照条件),20只Wistar大鼠随机分为四组,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,每组5只,其中Ⅰ、Ⅱ组为对照组,Ⅲ、Ⅳ组为实验组。实验组采用改良的单一连续应激方法建立PTSD大鼠模型(禁锢2h,强迫游泳15min,乙醚麻醉至大鼠昏迷,足底电击5s)。对照组大鼠单纯性饲养不做任何处理
3.2 TUNEL方法检测海马神经元凋亡
3.2.1 标本预处理:造模成功后将所有大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉,暴露心脏,用4%多聚甲醛溶液(pH=7.4)250mL灌流固定,直到大鼠四肢僵硬。同时处死对照组和模型组大鼠,剥离脑组织后将脑组织置于10%的中性福尔马林溶液中浸泡过夜。对照大鼠脑组织立体图谱对大鼠海马区进行取材,常规制作石蜡切片
3.2.2 脱蜡至水:(1)室温下将石蜡组织切片连续两次放入不同的二甲苯中浸泡,每次5min,以脱蜡彻底;(2)依次浸泡于浓度为100%、90%、80%、70%的梯度酒精各1次,每次2min,逐渐增加水分;(3)用PBS浸洗组织切片3次,每次5min,用滤纸小心吸干玻片上多余液体;(4)用疏水笔在组织周围圈出样本分布的轮廓,便于以下过程中组织标本的处理
3.2.3 增加样本的通透性:用PBS溶液配置终浓度为20ug/mL的蛋白酶K(不含DNase活性),每个样品需要100uL蛋白酶K溶液。在室温下,在每个样本上滴加100uL配制好的蛋白酶K溶液,使蛋白酶K溶液将样本完全覆盖,孵育20min。PBS轻轻润洗组织样本3次,每次5min。然后去掉多余液体,并用滤纸小心吸干在玻片上样品周围的液体。将处理好的样品放置在湿盒中以保持样本的湿润
3.2.4 配置标记反应液
3.2.5 标记反应:洗涤样本1次,轻轻吸干样本周围的缓冲液,注意不要触碰到样本。在每个样本上滴加50uL上述配置的标记反应混合物。将切片放置于湿盒中于37℃孵育60~90min
3.2.6 显色与结果判断:用PBS溶液孵育2次,每次1min,用滤纸吸干栽玻片上样品周围多余液体。室温下,用去离子水浸洗样本2次,每次5min,滴干载玻片上多余的水并用吸水纸擦拭样本周边的区域。用POD稀释液配制POD溶液(1∶25稀释)在每个样本上滴加50uL POD溶液,37℃放置30min。DAB显色液A和B混合稀释成1X工作液。PBS洗涤载玻片3次后,加入50~100uL DAB底物,室温放置10min。PBS洗涤载玻片3次,除去多余底物后,苏木素复染数s,自来水冲洗2min,盐酸酒精分化2s,自来水冲洗2min,室温下依次用50%、70%、85%、95%梯度酒精脱水
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