2011分子实验-许雷.ppt

7.10 质粒DNA提取－碱解法 DNA的酶切技术 DNA酶切片段脱磷技术 7.11 基因组DNA提取 DNA片段的重组连接技术 受体菌感受态细胞的制备 7.12 总RNA的提取 mRNA的提取及纯化 7.13 PCR/RT-PCR扩增 18sRNA片段 PCR片段回收 PCR片段克隆 DNA提取 DNA提取原则 DNA结构完整 不存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 无其他核酸分子的污染 DNA的提取方法 染色体DNA的提取 CTAB法 SDS法 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNA提取 原理： 热裂解 试剂作用 : NaCl, SDS, EDTA, Tris-HCl 试验材料： 植物叶片，菌体，菌丝等。 方法步骤：A. 预处理：清洗、剪切、研磨； B.??????? 液氮降温，研磨； C.?????? 裂解，高温/低温； D.?????? 纯化：蛋白（苯酚，酚仿，氯仿），RNA； E.??????? 溶解，定量（电泳/比色），检测，保存。 电 泳 0.5~0.6％ARGAROSE； 比 色 50ug/ml DNA; OD260/OD280=1.8， 40 ug/ml RNA; OD260/OD2801.8。 质粒DNA提取 常用RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）： 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 。 异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 提取RNA的注意事项 全部实验过程中均需戴手套操作，所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染。 玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上； 塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用DEPC水彻底清洗，再灭菌或用氯仿浸洗，凉干。电泳槽可用0.5M NaOH或10％双氧水浸泡2小时后，DEPC水冲洗 0.1%的DEPC水溶液处理过夜,再用蒸馏水冲净，高压灭菌灭活； RNA提取的步骤 材料准备及裂解 杂质的抽提 RNA的沉淀和溶解 RNA的检测 电泳槽系统的处理 乙二醛化琼脂糖凝胶电泳 含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳 RNA纯度及浓度的检测 （A260=1 ，约40 μg/ mL RNA； A260/A280 约为1.9-2.1 ） RNA提取常见问题 操作步骤－ TRIzol试剂提取 在液氮下,研磨组织块 待液氮挥发后,将上述分散的组织约50-100mg转移至DEPC离心管中 TRIzol试剂600ul,充分悬浮，室温放置10min。 0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 4 ℃ 12000rpm离心15分钟，取上清液 上层水相吸至无菌离心管中 等体积氯仿抽提一次 等体积异丙醇，混匀，-80℃沉淀10分钟。 4℃，12000rpm离心,10分钟，沉淀RNA 70％乙醇洗沉淀 干燥 复溶于DEPC水中，室温放置。 分子标记 分子标记是继形态标记、细胞生物学标记和生化标记等后的又一种新的遗传标记 分子标记直接以基因或基因转录产物为基础，可覆盖整个基因组或基因全体转录产物 应用于种质鉴定、图谱构建、基因定位、基因克隆、分子标记辅助选择和育种等方面 DNA-DNA杂交为基础的分子标记 RFLP（restriction fragment length polymorphism）标记 VNTR（重复数可变串联重复）标记 基于PCR基础的DNA标记 随机引物的PCR标记 RAPD ISSR（inter-simple sequence repeat） 引物序列参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的ISSR引物序列(http://www.michael- smith.ubc.ca/services/NAPS/Primer_Sets/Primer.pdf) AP-PCR(arbitrarity primed polymerase ch