DGAT1基因K378N多态性与2型糖尿病及糖尿病肾病的关系论文.docVIP

　　DGAT1基因K378N多态性与2型糖尿病及糖尿病肾病的关系论文 刘海龙，江华，张菊，焦凯 【关键词】 糖尿病肾病 Study on diacylglycerol acyltransferase 1 gene K378N polymorphism in type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy 【Abstract】 AIM: To investigate orphism relates to Chinese type 2 diabetes mellitus（T2DM） and diabetic nephropathy （DN）. METHODS: Gene K378N polymorphism in the DGAT1 gene platedirected dyeterminator incorporation al controls. RESULTS: In the T2DM group, there al controls（P 0.05）. There ay not be associated ellitus, type 2；diabetic nephropathies；polymorphism,single nucleotide；diacylglycerol acyltransferase 1； templatedirected dyeterminator incorporation ega公司.核酸外切酶I、虾碱性磷酸酶、AcycloDNA聚合酶和荧光偏振检测仪Victor2购自PerkinElmer公司.荧光标记终止子AcycloTerminatorsTM （AcycloGTPR110/AcycloCTPTAMRA）为PerkinElmer公司专利产品.DNA引物5′CACACCCCACCTACCTGATGC3′及5′CCTGGGGGCTGGGATGG3′；探针5′CTTCTGGCAGAACTGGAA3′由上海博亚生物技术有限公司合成. 1.2方法 1.2.1DNA引物及探针设计根据引物设计的基本原则，应用DNAStar软件，结合TDIFP反应的特殊要求设计引物及探针.引物与探针序列不能重叠，探针的3′末端必须紧邻待测变异基因位点.特异性寡核苷酸探针及与变异碱基对应互补末端掺入的特异碱基GTP/CTP是基于DGAT1基因扩增片段内的序列及变异碱基设计的，扩增靶片段长度为140 bp（Fig 1）. 1.2.2DNA的提取及PCR扩增用标准酚/氯仿法由周围血白细胞内提取基因组DNA.取DNA模板5 μL，dNTP 150 μmol/L，引物各0.25 μmol/L，MgCl2 2.0 mmol/L, Taq DNA聚合酶16.67 nkat，反应体系共25 μl.PCR条件：95℃ 4 min；94℃ 30 s，52℃ 40 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃ 5 min，扩增靶片段DNA.标本DNA经扩增后所得产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测.将经回收、连接、转化、筛选、测序正确的发生和未发生变异的质粒DNA作为阳性和阴性标准品. 1.2.3DGAT1 K378N基因多态性的检测鉴定采用TDIFP方法对扩增产物中K378N变异碱基进行检测.首先消化处理：虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ混合物与PCR产物37℃孵育2 h，可分别降解PCR产物中残余的dNTPs和引物，避免对后续反应的干扰；而后80℃热处理15 min灭活酶.以此产物为模板与探针结合，再以AcycloGTPR110和AcycloCTPTAMRA这两种荧光标记终止子为底物，在AcycloDNA聚合酶及其缓冲液中于95℃ 2 min, 然后95℃ 15 s，50℃ 30 s，25个循环杂交延伸, 最后15℃延伸10 min，4℃保存. PCR产物模板与探针互补杂交，与模板互补的游离荧光标记终止子AcycloG/CTP掺入到探针末端，荧光素分子量增加，在荧光偏振检测仪上分别检测AcycloGTPR110（波长535 nm）和AcycloCTPTAMRA（波长595 nm）的荧光偏振（FP）值, 据两种荧光的FP值, 推断变异碱基类型. 统计学处理： 正态分布资料用x±s表示，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，组间均数比较采用t检验（方差不齐时用t′检验）或方差分析，疾病危险因素分析采用二分类Logistic回归，整个统计分析用SSPS 11.0软件处理. 2结果 2.1临床特征DN＋组和DN－与正常对照组的性别（Sex）、年龄(Age)、体质指数BMI，均无显著差异(P 0.05)，DN＋组和DN－的收缩压(SBP)及舒张压(DBP)水平高于正常对照组(P 0.0