HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定论文.docVIP

　　HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定论文 【摘要】 目的：建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库，并从中克隆鉴定出新的应答基因. 方法：分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA，用SMART PCR技术合成全长双链cDNA，经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组，分别衔接两个不同的接头，再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR，将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增.freelega公司，SMART PCR cDNA合成试剂盒、 PCRSelect cDNA消减杂交试剂盒、Advantage2 cDNA PCR试剂盒、PCRSelect Differential Screening试剂盒、NucleoTrap PCR纯化试剂盒及尼龙膜、单面乳胶胶片均购自Clontech公司，［α32P］ dATP购自北京福瑞生物工程公司核酸研究室. 1.2方法 1.2.1HBV感染培养人胎肝细胞［1-2］用纤维连接素包被培养皿，将冻存的22 g/L. 以感染细胞为检测方，以未感染细胞为驱动方，加T4 DNA连接酶1 μL（6.66 μkat），分别与接头1和2连接，16 h反应过夜后进行接头连接效率检测. 在鉴定连接效率满意 （ 25%）后，将连接有接头1和2的检测方ds cDNA 1.5 μL分别与1.5 μL驱动方ds cDNA在68℃下杂交8 h后，立即将经过第一次消减杂交的两组体系混合，另加新变性的驱动方cDNA 1 μL，68℃杂交12 h，稀释（1∶200）. 取1 μL稀释后的第二次杂交后产物做模板，在50×advantage Taq聚合酶作用下，以接头1和2的外侧序列分别为5′及3′引物，进行第1次PCR扩增；取第一次PCR产物3 μL，10倍稀释后取1 μL做模板，以接头1和2内侧序列分别为5′及3′的巢式PCR引物，进行第二次PCR扩增，并进行PCR产物消减效率检测. 1.2.3cDNA消减文库的构建及PCR鉴定克隆取3 μL PCR产物及2 μL线性化质粒载体，在1 μL T4 DNA连接酶的作用下，14℃反应12 h后，-20℃保存. 取2 μL连接反应产物转染200 μL感受态大肠杆菌，225 r/min摇菌1.5 h，取200 μL菌液种植于含氨苄青霉素的LB/Xgal/IPTG培养板上，37℃培育18 h. 计数培养板中直径 1 mm清晰的白色及蓝色菌落数. 随机挑取128个白色菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇菌过夜，取菌液1 μL做模板，以接头1和2内侧序列分别为5′及3′的PCR引物，进行PCR扩增，选取含有明确单一目的片断的克隆99个进行杂交筛选. 1.2.4斑点杂交法进行差异筛选取鉴定过的含有单一明确目的片断克隆的PCR反应液5 μL加5 μL 0.6 mol/L NaOH， 混匀变性； 取2 μL新鲜变性cDNA，分别点样于尼龙膜上；0.5 mol/L TrisCl（pH 7.6）中和，杂交炉中70℃烤膜2 h固定. 预杂交1 h后加入32P标记的4种探针：正向消减探针、检测相未消减探针、反向消减探针、驱动相未消减探针进行杂交过夜，加入探针的cpm值为107. 洗膜后进行放射自显影，选取差异表达的克隆. 用Ｍ（-20）引物测序，由北京鼎国公司代理. 2结果 2.1总RNA的定性定量分析紫外分光光度计检测检测相和驱动相胎肝细胞总RNA量分别为500和150 g/L，A260/280 1.8，10 g/L琼脂糖凝胶电泳见RNA的28 S和18 S亚单位十分清晰，二者比例约为1.5∶1，证实RNA质优量足. 2.2SMART PCR合成长距离ds cDNA在10 g/L琼脂糖凝胶电泳上见ds cDNA为0.5～8.0 kb的弥漫性条带. 2.3Rsa I酶切可见ds cDNA由0.5～8.0 kb的弥漫性条带降解为约0.2～2.0 kb的条带（图1），证实酶切十分成功. 图1Ds cDNA样品经Rsa I消化前后20 g/L琼脂糖凝胶电泳 2.4Ds cDNA两端接头连接效率检测将连接有接头1和2的两组胎肝细胞ds cDNA分别用G3PDH 3′, 5′引物及以G3PDH 3′引物和接头上5′引物进行PCR扩增. 结果显示两组胎肝细胞接头连接效率均 50%,即50%以上ds cDNA已与接头连接. 2.5两次抑制性PCR后的电泳两次抑制性PCR后分别取8 μL扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶电泳上可见正向和反向消减后的产物为约100～600 bp的弥漫性条带,而未消减前的产物为较大分子质量的弥漫性条带（图2）. 图2第2次PCR产物琼脂糖凝胶电