hHGF基因肾脏电转染对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用论文.docVIP

　　hHGF基因肾脏电转染对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用论文 李宓 杜艺 陈家湄 彭莉 邹和群 【摘要】 目的: 使用肾脏直接基因电转染方法对大鼠肾脏进行hHGF基因转染，观察该基因转染对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用. 方法: 雄性SD大鼠20只，随机分为转染组和对照组，每组10只. 在热缺血前3 d将含有hHGF基因的质粒用电转染方法转入大鼠肾脏，3 d后建立大鼠肾热缺血模型，观察hHGF的药代动力学，并对缺血肾脏进行功能和组织学评价. 结果: hHGF基因电转染组肾组织及血浆hHGF基因表达水平高于对照组(P 0.01). 转染组血肌酐水平低于对照组(P 0.01),肾功能恢复快于对照组. 组织学评价显示，转染组肾小管细胞凋亡评分低于对照组(P 0.05). 转染组淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润均较对照组少. 结论: 肾脏hHGF基因电转染组hHGF药代动力学和治疗效果均显示.freelAb（Oxford UK），ELISA hHGF检测试剂盒（Quantikin ）, CD45RC(Oxford UK), 马抗羊IgG（美国Vector Laboratories）,DAB显色剂（SigmaAldrich ），PARP凋亡过氧化酶试剂盒（西班牙Labclinics Barcelona ）,分光光度计（Beckman）, BTXECM830电转染机(Harvard Apparatus ). 1.2方法 1.2.1分组随机分为2组，A组：热缺血45 min+非治疗组（n=10）；B组：热缺血45 min+肾脏电转染组(n=10). 1.2.2引物设计用Primer分析软件设计1对引物，上游引物为5′ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA3′；下游引物为5′ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTGTTTCG3′；引物由大连宝生物工程有限公司合成. 以pRC/CMVhHGF为模板进行扩增，全长为1340 bp. cDNA PCR反应体系：50 μL，引物0.8 μg，模板0.1 μg，常规量dNTPs，Mg2+及Taq酶，反应体系95℃ 1 min，40℃ 50 s，70℃ 2 min,循环5次，95℃ 1 min，60℃ 50 s，72℃ 2 min，循环25次，72℃延伸5 min. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用EcoRI和BamHI消化后与载体pBSks连接. 产物用CaCl2法转化E.coli JMI09，以碱裂解法提取质粒 ，质粒DNA结合SP1017，结合后的基因治疗效果较裸体DNA电转染的治疗效果为佳，将质粒DNA溶解于的TE缓冲液中（浓度为4 g/L），等量的质粒DNA和2 g/L SP10170混合制成2 g/L的DNA及0.1 g/L的SP1017混和液备用. 1.2.3hHGF基因肾脏电转染手术暴露肾和肾蒂，在接近腹主动脉处用血管钳夹闭双肾动脉以防注入的液体流出，但肾动脉夹闭时间不能超过12 min以避免严重的缺血损伤，立即由双肾动脉注入400 μL含有hHGF质粒的混悬液及100 U胰岛素，用电极片夹起肾脏，并给以电脉冲，频率为1HZ，每次6个50 ms的电脉冲，电压为100 V［3］. 于电转染3 d之后，在37℃环境中，麻醉后切开腹腔，暴露左肾，夹闭肾A和肾V 45 min，然后打开. 常温下室内饲养1 in离心，取上清试管加盖后4℃冰箱保存，ELISA法检测hHGF. 1.2.4组织学评价及组织hHGF基因表达在缺血后8 d取大鼠左肾制成组织石蜡包埋块，并将包埋块切片（3～4 μm），脱蜡后分别用苏木素署红及PAS染色. 根据肾小管坏死和再生情况，从病理学角度将其分为0~3分. 0分：正常组织；1分：少于1/3的组织受损；2分：1/3~2/3的组织受损；3分：所有组织受损. 肾小管受损的评估标准为：细胞肿胀、凋亡，细胞支持消失，刷状缘破坏. 肾小管修复的标准：出现细胞核的有丝分裂. 肾组织hHGF基因表达检测采用免疫组化法，见文献［4］. 1.2.5巨噬细胞及淋巴细胞的免疫组化1抗使用1∶100稀释的鼠抗鼠mAb，作用于巨噬细胞的ED1， 1∶200稀释的鼠抗鼠mAb及1∶25稀释的羊抗人多克隆HGF抗体作用于T和B淋巴细胞蛋白CD45RC. 使用1∶200稀释的马抗鼠IgG作为二抗和1∶200稀释的马抗羊IgG，显色剂使用DAB显色［4］. 1.2.6组织过氧化物氧化评价大鼠肾组织中性粒细胞浸润通过白细胞MPO方法进行评估. 将组织中加入pH 6.0 50 mol/L的kd缓冲液中（含5 g/L的溴化十六碳烷基三胺）快速液氮冷冻，然后30 s解冻，重复3次，60℃孵育2 h,离心后取上清检测MPO，MPO用偶氮蓝和5