分析化学高效液色谱-HPLC.pptVIP

温 度：10～30℃；相对湿度：80％； 最好是恒温、恒湿远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施 工作原理： 手柄位在Load位置时，用微量进样针将样品从进样孔注射进入定量环中(定量环充满后，多余样品从放空孔排出) 手柄转动至Inject位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，将样品进入色谱柱中进行分析 手柄转动要快速：手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中途停留 样品必须过滤：用0.45(0.22)μm的滤膜过滤 防止微粒阻塞进样阀 减少对进样阀的磨损 进样结束冲洗进样器： 用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗， 在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗 再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧 2. 泵的保养 使用流动相尽量要清洁 进液处的砂芯过滤头要经常清洗 流动相交换时要防止沉淀 避免泵内堵塞或有气泡 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染 在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱 当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净 要注意流动相的脱气 避免使用高粘度的溶剂作为流动相 进样样品要提纯；严格控制进样量 3. 紫外灯的保养 在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器； 在分析完成后马上关闭检测器 K越大,溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈大,保留值愈大 磺酸型阳离子交换树脂,阳离子的保留值大小: 一价阳离子：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ 二价阳离子：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+ 强碱性阴离子交换树脂,保留值大小顺序: PO43-SO42-C2O42-I-HSO4-NO3-CN-NO2-Cl- HCOO-OH-F-CH3COO- 流动相 H2O、H2O + 乙醇、H2O + pH 缓冲剂 应用 无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等 4. 尺寸排阻色谱法 size exclusion chromatography SEC 凝胶过滤色谱: 水为流动相 gel filtration chromatgraphy GFC 凝胶渗透色谱: 非水流动相 gel permeation chromatography GPC 1959年?Porath和Flodin发明 分离原理: 试样分子的尺寸和形状不同来实现分离 GPC 流动相: 水、四氢呋喃 应 用: 聚合物的分级 生物聚合体（蛋白质，核酸，低聚糖, 多肽）的分离 §8.3 色谱分离方法的选择 了解样品的有关性质 样品的相对分子质量的大小 在水中和有机溶剂中的溶解度、极性和稳定程度 化学结构 熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围 1. 流动相种类与极性 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂 它可显著改变组分分离状况 选择流动相在液相色谱中特别重要 按组成可分为： 单组分和多组分； 按极性可分为： 极性、弱极性、非极性； 按使用方式可分为：固定组成淋洗和梯度淋洗 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间 选择流动相时应注意的几个问题： （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 §8.4 应用实例 方针：要解决一个分析问题，先试反相色谱法 C18标准柱，改变流动相调节k（保留行为）和α（选择性） 反相色谱法优点： a.色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱 b.流动相主体为水，甲醇为有机改性剂，价廉易纯化 c.tR 随溶质的疏水性增加而增大，可预计出峰顺序 d.改变基本流动相的pH，添加盐缓冲剂，金属螯和物，手性试剂等，