MTT法分析含药血清对体外培养肺癌细胞增殖的影响论文.docVIP

　　MTT法分析含药血清对体外培养肺癌细胞增殖的影响论文 .freelonary giant cell carcinoma，PG）的低转移亚系LH7（PGLH7） ［1］ 由北京大学医 学部病理系提供。 1.1.2 主要试剂及设备 RPMI 1640（美国GIBCO），胰蛋白 酶（美国SIGMA）;噻唑蓝（美国SIGMA）;二甲基亚砜（北京北 化精细化学公司）。高速低温离心机（美国SIGMA）;超净工 作台（北京半导体设备一厂）;CO 2 恒温孵育箱（法国Jouan）。 1.2 实验方法 1.2.1 药物制备及剂量 莪术瓜蒌汤（简称“莪瓜汤”）由莪 术、天龙、沙参、全瓜蒌、龙葵组成，购于湖北中医学院附属医 院。将上述中药饮片置煎煮容器内，加水浸泡，煮沸，过滤浓 缩，用蒸馏水倍比稀释成含生药2.10g/ml、0.70g/ml、0.23g/ ml的水煎剂，分别作为高、中、低剂量灌胃药液。根据“人和动 物体表面积折算的等效剂量比率表” ［2］ ，本实验所选具体剂量 为:家兔用药量（g.kg -1 .d -1 ）=人日用剂量×0.07/1.5 （g. kg -1 .d -1 ）。莪术瓜蒌汤剂量标准为3.50 （g.kg -1 .d -1 ）。中 剂量:为上述标准剂量;高剂量:为标准剂量的3倍;低剂量: 为标准剂量的1/3倍。 1.2.2 含药血清的制备 健康家兔16只（湖北中医学院动 物房提供），雄性，体重1.8 kg～2.0 kg。随机分成4组:空白 对照组、莪瓜汤低剂量组、莪瓜汤中剂量组及莪瓜汤高剂量 组。给药前禁食10～12 h，不禁水。各组家兔于每日早、晚各 灌胃给药一次，每次2.5ml/kg，共2次。按通法方案制备含药 血清 ［3］ ，实验分组:对照兔血清组、莪瓜汤低剂量血清组、莪瓜 汤中剂量血清组、莪瓜汤高剂量血清组、ATRA血清组。同组 血清混合，56℃水浴中灭活30min，用0.22μm的微孔滤膜过 滤除菌，置-20℃保存备用。 1.2.3 人肺癌细胞的培养 PGLH7细胞株，用含10%热灭活 新鲜小牛血清的RPMI 1640于37°C、5% CO 2 孵育箱中培养。 生长旺盛的细胞每2天传代一次。 1.2.4 MTT法检测癌细胞生长抑制率 用胰酶消化细胞，用 常规培养基配成细胞悬液种入96孔板，板周边的孔不加细 胞，防止有边缘效应。留空白孔调零，以只加培养液不加细胞 作空白对照。在37℃、5% CO 2 的培养箱内培养24 h后，分别 加入不同剂量的含药血清和对照血清。每组设4个平行孔， 继续培养24h，加入MTT溶液20ul继续培养4 h，终止培养，弃 培养液，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150ul/孔， 振荡，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度 A 值，比色时以空 白孔调零。按照上述同样方法检测培养48 h、72 h的 A 值。 根据公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率=（空白对照 组 A值-实验组A值）/空白对照组A 值×100%。 1.3 统计学分析 数据处理采用方差分析。 2 结果 10% 的含药血清作用PGLH7细胞24h、48h和72h的吸 光度值见表1。 由表1可以看出:莪术瓜蒌汤低、中剂量血清组与对照血 清组之间的PGLH7细胞吸光度差异无统计学意义，而莪术瓜 蒌汤高剂量血清组则与对照血清组之间的吸光度差异有显著 统计学意义（ P 0.01）;同时可以看到高剂量血清组随着作用 时间的延长，其吸光度逐渐降低，抑制率逐渐增高，但无统计 学差异。上述结果提示，10% 莪术瓜蒌汤高剂量血清组对 PGLH7细胞的增殖可能具有明显的抑制作用，并有随时间延 长而作用愈明显的趋势。 表1 莪术瓜蒌汤含药血清作用不同时间对PGLH7细胞增殖的影响注:* 与同一时点对照血清组比较， P 0.01。 3 讨论 “莪术瓜蒌汤”是名老中医邱幸凡教授治疗肺癌的主要方 剂，是根据“痰瘀浊气凝结于肺”的病理特点而立法、组方、用 药的，临床治疗肺癌取得了一定疗效。中药复方多数是通过 口服而起作用的，用中药粗制剂直接加入离体反应体系中进 行实验研究，在方法学上存在很多问题，如中药中的杂质成 分、各种电解质或鞣质、以及不同酸碱度的影响等，都会对实 验结果造成一定的影响。中药血清药理学实现了体外实验和 体内实验的较好结合，在方法学上具有创新性，可以排除以上 各种因素的影响，比较接近药物体内环境中产生药理效应的 过程，目前是研究中药药理学的一种较为理想的方法 ［4］ 。为 了减少因种属差异而造成的免疫反应，实验动物应尽量选用 与人类生物学特性近似的物种，以家兔和大鼠为首选。李仪 奎等 ［3］ 提出中药血清药理研究的通用给药方案（通法）并给出 增大给药剂量以部分地弥补含