oxLDL和生理浓度抗坏血酸对人脐静脉内皮细胞eNOS活性的影响论文.docVIP

　　oxLDL和生理浓度抗坏血酸对人脐静脉内皮细胞eNOS活性的影响论文 张泉三 董果雄 张社华 【摘要】 目的 探讨氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和生理浓度抗坏血酸对乙酰胆碱诱导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性及一氧化氮（NO）生成量的影响及其可能机制。方法 在培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中加入25、50、100 mg/L的oxLDL和生理浓度抗坏血酸作用24 h后，测定NO生成量、eNOS活性及细胞内谷胱甘肽（GSH）含量。结果 oxLDL以剂量依赖方式降低乙酰胆碱诱发的eNOS活性，减少NO的生成；生理浓度抗坏血酸改善eNOS活性，同时增加NO生成，差异均有显著性（F=50.075、48.400，q=3.773～19.998，P 0.05、0.01）。而细胞内GSH的含量在oxLDL （50 mg/L）组与抗坏血酸组无明显差异。结论 oxLDL通过降低eNOS活性而减少NO的生成。生理浓度抗坏血酸通过直接影响eNOS活性而抑制该效应，此与其抗氧化作用无关。 【关键词】 脂蛋白类 LDL 抗坏血酸 内皮细胞 一氧化氮 一氧化氮合酶 ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects and its mechanism of oxidized loan umbilical vein endothelial cells. MethodsThe endothelial cells ol/L) and subsequently exposed to different concentrations of oxLDL from 0 to 100 mg/L for 24 h at 37 ℃. NO production, eNOS activity, and level of glutathione easured. ResultsoxLDL decreased eNOS activity and NO production in a dosedependent manner. Lascorbic acid at physiological concentration enhanced eNOS activity and NO production, g/L) group and Lascorbic acid group. ConclusionoxLDL may decrease NO production via attenuating NOS activity in HUVECs. Lascorbic acid at physiological concentration ameliorates eNOS activity ol/L的PBS中透析，去除离心制备过程中所加的抗氧化剂；然后用PBS溶液将LDL稀释至蛋白质量浓度为0.5 g/L；加入到新鲜配制的含10 μmol/L硫酸铜的PBS中37 ℃氧化12 h，然后在4 ℃含100 mg/L EDTA的PBS中透析24 h，以终止氧化修饰反应。将制备好的oxLDL以0.22 μm滤膜过滤除菌，置4 ℃保存备用。LDL氧化修饰程度用硫代巴比妥酸反应物质的含量来鉴定。 1.3 HUVECs株的培养 HUVECs株用含体积分数0.15小牛血清的DMEM培养液在37 ℃培养箱内培养3～5 d，待细胞融合后，用0.5 g/L胰蛋白酶与0.2 g/L EDTA进行消化。显微镜下观察到细胞收缩变圆时弃去消化液,加入培养液以终止胰蛋白酶作用。用滴管吹打壁上的细胞，使其完全脱落并分离。调整细胞浓度至3×108/L,接种于24孔板上培养。待细胞融合后，换用无血清无酚红DMEM培养液,.freelL的培养液；25、50、100 mg/L oxLDL组（②、③、④组）：分别加入相应浓度的oxLDL各1 mL；抗坏血酸组（⑤组）：先加入100 μmol/L的L抗坏血酸1 mL预处理24 h，然后再加入50 mg/L的oxLDL 1 mL。以上各组在测试前1 h分别加入1 μmol/L的乙酰胆碱。 1.5 测定指标及方法 1.5.1 NO NO-2及NO-3为NO的稳定代谢产物，已被证实为指示NO产生水平的优良指标。分别收集各组细胞培养液，按照NO测试盒说明书操作测定NO-2及NO-3的含量。 1.5.2 NOS活性 NOS催化L精氨酸和分子氧反应生成NO，NO与亲和性物质生成有色化合物，在530 nm波长下测吸光度，根据吸光度的大小，计算出NOS活力。操作按试剂盒说明书进行。 1.5.3 GSH 用超声细胞粉碎仪将内皮细胞粉碎、离心，取上清，应用比色法测定GSH的含量。操作按试剂盒说明书