S100A4, A10在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达及意义论文.docVIP

　　S100A4, A10在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达及意义论文 柏干苹，周丽娜，贺伟峰，罗高兴，陈烯伟，陈光兴，胡晓红，石东文.freel rheumatoid arthritis (RA) patients and normal controls using tensional gel electrophoresis (2DE) and bioinformatics for providing useful and neent of RA. METHODS: The total protein of SFs from either RA patients or normal ones eans of immobilized pH gradient based on 2DE. Gels ages atrixassisted laser desorption ionizationtimeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS). Then some of them munocytochemistry. RESULTS: 896 protein spots al individuals, and 992 spots in RA, respectively. There RA binding protein S100A4 and S100A10. EM培养液，置于37℃ 50 mL/L CO2孵箱中令其贴壁生长，细胞生长至85%满时，胰蛋白酶消化进行1∶2传代. 本实验中采用3～5代滑膜成纤维细胞. 1.2.2 细胞总蛋白质的制备［5］ 取3～5代培养滑膜细胞，待细胞生长至融合期时，吸出培养液，用胰酶消化，PBS液洗涤细胞3次后，加入细胞裂解液（尿素7 mol/L，硫脲2 mol/L，CHAPS 40 g/L，DTT 65 mmol/L，pharmalyte 2 g/L）充分混匀，14 000 g，4℃离心1 h，取上清，用Bradford方法测定蛋白含量，并分装于-80℃冻存备用. 1.2.3 双向电泳 采用pH 3～10 NL IPG胶条进行2DE分析. 按BioRad双向电泳操作指南进行. 400 μg蛋白样品加入水化样品缓冲液(8 mol/L尿素，20 g/L CHAPS，pH 3～10的5 g/L IPG缓冲液，18 mmol/L DTT，0.02 g/L溴酚蓝)中溶胀后进行等电聚焦. 程序设置如下:250 V、线性、30 min；1000 V、快速、1 h；10 000 V、线性、3 h；10 000 V、快速、40 000 Vh；500 V、快速、任意时间保持. 等电聚焦电泳后IPG胶条经平衡转移至1 mm厚的120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶上端进行第二向SDSPAGE电泳. 1.2.4 银染及凝胶图像采集分析 SDSPAGE胶按照文献［6］的方法进行硝酸银染色后，应用校准型光密度仪，凝胶定量软件进行扫描获取图像. 数字化图像文件运用双向电泳凝胶分析软件对图像进行分析，图像分析过程包括蛋白点的检测、量化、背景消减和点的匹配，进行强度校正、点检测、背景消减、匹配、1 D校正、建立平均凝胶分析等. 1.2.5 质谱鉴定 切割蛋白质点置于微量离心管中，经洗涤、脱色及进行胶内蛋白质酶解后，将从蛋白质差异点抽提所得的肽段通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Autoflex）进行分析，获取蛋白样品的肽质量指纹图，最后应用肽质量和碎片离子检索分析软件（Mascot）在人类蛋白质公共数据库（NCBI、SA). 染色程序按SP试剂盒说明书进行，每批染色均设立空白对照，以PBS液代替一抗. 免疫荧光细胞化学法检测S100A4. 用冷的甲醇固定，-20℃ 10 min； -20℃用冷的丙酮渗透1 min. 水洗后，一抗孵育，37℃孵育45 min. PBS冲洗5 min×3次， PBS稀释标记二抗1∶100，室温孵育30 min. PBS冲洗5 min×3次，甘油缓冲液（9份优质甘油加1份pH 7.4 PBS液）封片，并对染色后的细胞片进行显微镜下观察、摄片. 每张切片随机观察5个高倍视野，应用Image Pro Plus 5.0图像分析系统进行处理，随机选场，自动采点分析，测得阳性细胞积分吸光度值, 分析比较S100A4，S100A10，αSMA表达量的变化（积分吸光度值越高，表示阳性细胞区域越大或信号越强）. 2 结果 2.1 滑膜成纤维细胞蛋白质组图谱差异分析及差异蛋白鉴定 应用双向电泳,获得了重复性较好的滑膜成纤维细胞的双向电泳银染图谱(图1). 正常人及RA患者2DE银染图谱上分别平均显示896,992个蛋白质点. 有64个蛋白点