Vip3A基因植物表达载体的构建和烟草的遗传转化.pdfVIP

Vip3A基因植物表达载体的构建及烟草的遗传转化1 马作江，邓伟，杨迎伍，李正国 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心，重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室重 庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心，重庆 （400044 ） E-mail：zhengguoli@ 摘 要：为了研究Vip3A基因在转基因抗虫植物中的应用，利用PCR技术克隆了苏云芽孢杆 菌的Vip3A基因和烟草的EF1α启动子，以pBI121质粒为基本载体，构建了分别由组成型 CaMV35S启动子和花特异表达的EF1α启动子驱动Vip3A基因的植物表达载体pBIVip3A 和 pBIEFVip3A ，并通过农杆菌介导的方法对烟草进行了遗传转化。经PCR检测，外源基因已 整合到烟草基因组中。 关键词：Vip3A基因；EF1α启动子；苏云金杆菌；载体构建；烟草 苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）在其营养生长期分泌的一种杀虫蛋白，称为营养期 杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein, vip)[1]，因其对δ内毒素（或ICPs ）产生抗性的昆虫有 很强的毒杀效果而引起了广泛关注。已有研究报道了一些vip蛋白基因家族[2]，被认为是第二 代杀虫基因[3] 。目前vip基因的应用主要是转基因植物，2006年，美国转vip3A基因抗虫棉花 已投入商业生产，其它的报道也都已申请了专利，国内迄今为止尚未见报道。vips基因与ICPs 基因没有任何同源性，其杀虫作用机理与ICPs也不相同，是一种广谱性杀虫蛋白。其中以 Vip3A研究最为清楚，目前发现它对小地老虎有高杀虫活性，比Cry1Ac毒力高260倍。对草 [4] 地贪夜蛾、甜菜夜蛾、烟芽夜蛾、美洲棉铃虫等有较好杀虫活性 。 用于植物转化的启动子大部分是组成型表达的CaMV35S启动子。2005年，Ryutaro等在 [5] 烟草中获得了EF1α启动子（elongation factor 1α promoter ） ，且证明了EF1α启动子是一种 很好的花组织高效表达启动子。因此，该启动子对基因的组织特异性表达具有重要价值。 为了研究Vip3A基因在植物中的表达状况，我们分别将Vip3A基因与CaMV35S启动子和 EF1α启动子进行构建，并通过农杆菌介导进行烟草转化，为研究Vip3A基因在植物特定的易 受害虫危害的部位高效表达、提高抗性等方面提供参考。 1 材料与方法 1.1 植物材料及菌种 烟草（Nicotiana tabacun ）、苏云芽孢杆菌菌株（Bacillus thuringiensis ）、大肠杆菌 （Escherichia coli ）JM109菌株、农杆菌菌株 （Agrobacterium ）GV3101及植物表达载体pBI121 为本实验室保存。 1.2 工具酶及分子生物学试剂 限制性内切酶HindIII、BamHI 、SacI、Taq DNA 聚合酶、高保真PrimeSTAR HS DNA 聚 合酶均购自均购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司；DNA marker （DL2000 、 MD113 ）、DNA 回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购自北京天为时代科技有限公司；其它生 化试剂都为国产分析纯。 1.3 引物的设计及PCR扩增 根据文献报道的Vip3A基因序列（GenBank登录号为BACVIP3AA ）、EF1α启动子序列 1本课题得到国家自然科学基金(No. 3471214)和重庆市科委自然基金重点项目(No. 2007BA1005)的资助。 - 1 - （GenBank登录号为BD438335 ），分别设计一对特异性全长引物，并引入合适的酶切位点， 引物合成