壮药壮通饮对大鼠内源性脑神经干细胞归巢后神经元功能影响.docVIP

壮药壮通饮对大鼠内源性脑神经干细胞归巢后神经元功能影响 　　【摘要】目的：观察壮药复方壮通饮对脑梗死模型大鼠内源性神经干细胞归巢后神经元功能的影响。方法：240只大鼠分为模型组、假手术组、壮通饮治疗组、正常组，采用线栓法制作脑梗死模型，于术后1、3、7、14、21、28d这6个时间点分批处死大鼠。用免疫组化法检测大鼠海马区BrdU、Nestin和梗死区域及相对应区域的MBP、SYN的阳性细胞数目。结果：模型组脑缺血区域相对应区域MBP、SYN阳性细胞大量表达，正常组和假手术组海马区少量BrdU、Nestin阳性细胞。模型组和壮通饮治疗组BrdU、Nestin阳性细胞表达增多，MBP、SYN阳性细胞表达减少。壮通饮治疗组BrdU、Nestin、MBP、SYN阳性细胞表达量多于模型组，BrdU、Nestin阳性细胞表达在第7天达到高峰，MBP、SYN阳性细胞表达于第14天达到高峰。结论：壮通饮可以促进脑梗死后内源性神经干细胞的增殖，诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，并发挥正常的神经功能 【关键词】壮通饮；内源性神经干细胞；NSC；归巢；神经元 【中图分类号】R29【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）08-0029-06 脑梗死是临床上常见的缺血性脑血管疾病，随着中国进入老龄化社会，脑梗死发病率和致残率呈增高态势，脑梗死区域的神经细胞的凋亡是必然的[1]。神经细胞是不可再生是长期以来的共识，作为神经细胞和神经胶质细胞的前体，内源性神经干细胞（Neural Stem Cell，NSC）具有增殖、迁移及分化功能，在脑缺血后神经损伤的修复过程中扮演重要角色[2]。壮通饮是治疗脑梗死的壮医药经验方，前期研究发现壮通饮影响新生大鼠海马神经干细胞增殖分化[3]。本实验通过观察壮通饮对脑梗死后内源性神经干细胞归巢后的神经元功能的影响，为阐明壮通饮促进神经增殖分化为成熟神经元后功能机制提供实验依据 1实验材料 11实验动物选用清洁级雄性健康SD大鼠240只，体重（250±10）g，由广西医科大学动物实验中心提供（批?：SCXK桂～0004） 12试剂鼠抗BrdU单克隆抗体（批号：BM0201）、兔抗nestin多克隆抗体（批号：A00806-1）、兔抗MBP多克隆抗体（批号：BA0094）、兔抗SYN多克隆抗体（批号：A00941）、山羊抗兔IgG（批号：1512174091）、ABC试剂盒（批号：d0110816）、DAB试剂盒（批号：AR1022）均购自武汉博士德生物工程有限公司 2方法 21动物分组将240只大鼠随机分为模型组、假手术组、壮通饮治疗组、正常组，每组又设1、3、7、14、21、28d 6个时间点。每个时间点10只大鼠 22药物制备壮通饮：扶芳藤30g，参三七10g，黄花倒水莲25g。药材煎煮两次，合并两次煎液，蒸发去水分至浓稠状，进一步干燥，4℃保存备用。临用前使用蒸馏水溶解浸膏至生药材含量为20 g/mL 23MCAO模型建立参照Longa线栓法[4]制作MCAO模型。模型制作成功标准如下：①提尾悬空实验阳性；②右眼Horner征；③爬行时向左划圈；④站立时向左侧倾倒。假手术组除不进行大脑中动脉线栓外，其余操作均同模型组 24给药方法壮通饮治疗组在造模后给予壮通饮水煎液（按单位体重的剂量来算，大鼠的等效剂量相当于成人用量的63倍[5]，灌胃，每日2次，每次748g生药/kg，其他组同时给予等体积的无菌蒸馏水灌胃，灌胃至造模后1、3、7、14、21、28d 6个时间点处死时 25BrdU标记增殖细胞各组动物均从处死前24h开始，腹腔注射BrdU（50mg/kg），1次/4h，共4次，末次注射后12h处死动物 26组织切片制备各组大鼠于造模后1、3、7、14、21、28d 6个时间点取标本，将脑组织移入多聚甲醛中4℃固定6h，取材，脱水，包埋，切片 27免疫组化方法切片经脱蜡，高温修复后，加入配好的03%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80mL+001MKPBS 100mL+30%过氧化氢）30min，用001MKPBS溶液冲洗后，加入10%正常羊血清，室温静置30min，甩干分别加相应的一抗，4℃过夜。用001MKPBS溶液冲洗后，滴加生物素化二抗（山羊抗兔IgG），室温静置30min，用001MKPBS溶液冲洗后，加入辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液，室温静置30min，用001MKPBS溶液冲洗，采用SABC法染色，切片加葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺溶液显色（不超过5min），自来水冲洗干净，苏木素复染2min，自来水冲洗，梯度酒精脱水，树胶封片，光镜下观察 28观察指标分别观察各指标免疫组化染色阳性细胞的分布特点及形态特点。