补肾法对酒精干预成骨样细胞蛋白质表达影响的实验及相关临床研究.pdfVIP

2．1．1细胞生长曲线绘制． 选择合适密度的0S-732成骨样细胞，给以血清浓度为10％的六味地黄丸高、中、 低剂量组和空白对照组(即生理盐水灌胃)血清连续培养7天。显微镜观察并计数， 绘制细胞生长曲线，发现药物组的增殖作用均较空白血清组强，高、中剂量组含药血 清对细胞有较强的刺激作用，而又以中剂量组的作用最强，3—6d为对数生长期。 2．1．2 MTT法测定OS一732成骨样细胞的增殖试验 选择合适密度的0S-732成骨样细胞，给以血清浓度为10％的六味地黄丸高、中、 低剂量组和生理盐水空白对照组血清进行连续培养j天，每天酶标仪测定吸光值，结 果： 培养24h、48h未见明显差异，但培养第3d、4d、5d后，高、中、低剂量组的增 殖作用均较生理盐水空白对照组强，又以中剂量组最为明显，具有统计学意义，高、 低剂量组无统计学意义 2．1．3 0S-732成骨样细胞分泌ALP的实验研究 选择合适密度的0S-732成骨样细胞，给以血清浓度为10％的六味地黄丸高、中、 低剂量组和生理盐水空白对照组血清进行培养，分别在培养第3d、4d、jd后进行碱性 磷酸酶试剂盒检测，酶标仪测定oD值 结果：高，中、低各剂量组均比生理盐水空白组高，但以中剂量组最为明显，具 有统计学意义。高、低剂量组无统计学意义。 2．2OS一732成骨样细胞酒精干预和六味地黄丸含药血清治疗作用的实验研究 2．2．1OS一732成骨样细胞不同浓度酒精干预下细胞凋亡率检测 选择生长良好合适密度的OS一732成骨样细胞，分别加入不同浓度的酒精进行孵育， 乙醇固定、PI液染、流式细胞仪检测。 结果：酒精干预各组细胞凋亡率明显比空白对照组增高，具有显著意义(pO．05)， 随着酒精浓度的增加，干预时间的延长，凋亡率逐渐升高，凋亡率与酒精浓度呈正相 关，与干预的时间成正相关。 2．2．2 OS一732成骨样细胞酒精干预后电子显微镜观察 分为正常0S-732成骨样细胞组，酒精干预组，酒精干预后加六味地黄丸含药血清 治疗组。 透射电镜下的表现：正常成骨样细胞核较大，呈多型性，核仁明显，细胞质中可 见较多的核糖体、高尔基体及溶酶体样颗粒。给予酒精干预后部分细胞器发生变化， 核糖体、内质网减少，出现较多空泡，可以见到典型的细胞凋亡表现，细胞核固缩碎 裂。药物治疗后细胞质内的细胞器从结构上有所恢复，内质网、高尔基体清晰可见。 2．30S-732成骨样细胞酒精干预和六味地黄丸含药血清治疗后差异蛋白表达的初步分 n 析 成骨样细胞分为酒精干预组、药物治疗组、空白对照组。每组细胞提取总蛋白后 进行双向凝胶电泳技术分离，得出蛋白质点电泳凝胶图谱，然后进行计算机图像分析 软件分析。结果，发现酒精干预组与空白正常组相比，表现明显差异的蛋白点有5个 个蛋白在药物组中其表达差异得到不同程度的逆转。 2．4补肾法治疗酒精性股骨头坏死的临床研究 以六味地黄丸合并生脉成骨片与单一生脉成骨片进行疗效比较。对69例酒精性股 骨头坏死患者进行系统的临床观察。结果表明，两组均有较高疗效，合并用药组有效 率83．78％，单一用药组81．25％，两组比较无显著差异。从缓解疼痛指标看，合并用 药组优于单一用药组，具有显著差异性(P：0．0028)；从治疗前后的体征改善方面观 察， 合并用药明显优于单纯用药组(JDO．05)。在影像学方面，两组的死骨吸收，新 骨形成，骨膜反应等方面没有明显差异。 3结论 3．1六味地黄丸含药血清对OS一732成骨样细胞具有增殖作用，促进细胞分泌ALP。 3．2一定浓度的酒精可以引起OS一732成骨样细胞凋亡，细胞凋亡与酒精浓度和干预 时间成正相关。从倒置显微镜、透射电子显微镜不同角度观察到细胞受损的表现， 可以见到细胞死亡和凋亡，存活的细胞可见空泡样改变。 3．3采用蛋白组学双向电泳技术发现酒精干预后受损的08-732成骨样细胞部分蛋白 质表达下调，中药六味地黄丸含药血清可以逆转其部分表达，说明具有治疗作用。 3．4六味地黄丸为补肾法的代表方，在临床观察中发现对酒精性股骨头坏死有较好疗 效，结合活血化瘀方法可以提高疗效。 关键词补肾法酒精08-732成骨样细胞差异蛋白质股骨头坏死 Ill andclinicalon ofthehuman Ex