嗜线虫致病杆菌北京变种基因组文库的构建及抗生素活性克隆的筛选.pdfVIP

维普资讯 23(4)394—396 中国生物防治 ChineseJournalofBiologicalControl 2007年 l1月 嗜线虫致病杆菌北京变种基因组文库的构建 及抗生素活性克隆的筛选 龚永兴，杨怀文 ，杨秀芬，刘 峥，袁京京 (中国农业科学院植物保护研究所 ，北京 100081) Construction ofGenomicLibraryofXenorhabdusnematophila var．pekingensis andScreeningofAntibiotics-activeCosmidClones GONGYong—xing，YANGHuai-wen，YANGXiu—fen，LIUZheng，YUANJing—jing (InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgric~turalScience，Beijing100081，China) 关 键 词 ：嗜线虫致病杆菌北京变种；初生型；粘粒文库；抗生素活性 中图分类号：Q939．1；Q785 文献标识码 ：A 文章编号：1005—9261(2007)04．0394．03 嗜线虫致病杆菌北京变种 (Xenorhabdusnematophilavat．pekingensis)是本实验室从北京郊 区土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫 (Steinenemacarpocapsae)的共生菌。该菌的代谢产物具有杀 虫、抑菌、抗癌等生物活性 ，其诸多抗生素活性物质有着诱人的开发利用前景l1J。因此，对该 菌株生物学、遗传学及分子生物学进行研究，可以为更好地开发利用该菌株提供理论依据 ，并 为获得新的功能基因奠定基础。本研究利用试剂盒pWEB：：TNC CosmidCloningKit构建了嗜 线虫致病杆菌北京变种的基因组文库。然后利用抑菌活性检测 ，对抗生素合成基因粘粒克隆 的筛选进行了尝试。这在国内外尚未见相关报道。 1 材料与方法 1．1 主要材料与试剂 嗜线虫致病杆菌北京变种初生型菌株和抑菌活性测定指示菌枯草芽 孢杆菌 (Bacillussubtilis)均 由本实验室提供。粘粒文库构建试剂盒 pWEB：：TNC Cosmid CloningKit购 自Epicentre公司。抗生素检定培养基购 自北京三药科技开发公司。 1．2 总DNA的提取 从活化的嗜线虫致病杆菌北京变种菌株的NBTA平板上挑取单菌落接 种到含 150mlLB培养基 中，28℃、180r／min振荡培养过夜 ，0 值达到0．6左右。将培养液 12000r／min离心5min，弃上清。9．5mlTE悬浮沉淀 ，并加0．5ml10％SDS，5OF120mg／ml(或 1mg 干粉)蛋 白酶 K，混匀，37℃保温 1h。分别加入 1．5ml5mol／LNaC1和 1．5mlCTAB／NaC1溶液，混 匀 ，65℃保温 20min。用等体积酚／氯仿 ／异戊醇 (25／24／1)和氯仿／异戊醇 (24／1)抽提 ，然后加 入0．6倍体积异丙醇 ，一20℃静置 30rain。离心，将沉淀悬浮于 lOml超纯水中。加入 RNase， 37℃水浴 30rain。再用氯仿／异戊醇 (24／1)抽提，离心后在上清液中加入 1／10体积 3mol／L 收稿 日期 ：2007．05-28 基金项 目：国家 自然科学基金(300705619) 作者简介 ：龚永兴(1970一)，博士，E-mail：yxgong@126．corn；*通讯作者，博导，E-mall：huaiweny@263net。 394 维普资讯 第 4期 龚永兴等 ：嗜线虫致病杆菌北京变种基因组文库的构建及抗生素活性克隆的筛选 NaAc，加入2倍体积预冷的无水 乙醇 ，一20℃放置 30min。离心 15min，用 70％的乙醇洗涤沉 淀。自然风干后 ，加入 1～2ml超纯水溶解 DNA。紫外分光光度计测定 OD235、OD260和OD28o，判 定提取的基因