2第二章基因工程的酶学基础.pptVIP

复 习 基因工程的酶学基础 DNA-分子间的连接是通过DNA-连接酶完成的 2.3 DNA的体外连接 （1）. 用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 （2）. 用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接 （3）. 用TDT酶给具平末端的DNA片断分别加上poly(A)或 poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。 （4）. 先在平DNA末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接。 1、碱性磷酸化酶有: 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CAP）68°C时失活 ， 来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）68°C稳定，且耐酚抽提. 能特异性地除去DNA-或RNA-分子末端的5`-磷酸： 5‘ p OH 3‘ DNA or RNA 5‘ ppp dN 5‘ pppN BAP / CAP OH 3‘ 5‘ HO 5‘ HO dN 5‘ HO N 作用： 去除载体DNA5’端磷酸化，防止载体自身环化，减低本底，提高重组率。 当外源DNA与载体连接时，由于具粘性末端的载体易发生自连。首先对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。 而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’- OH 和5’- OH 的缺口。 去除DNA和RNA的5‘端磷酸基，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记 脱磷酸化的目的就是防止载体自连 此缺口将在大肠杆菌中被修复酶修补 2、多核苷酸激酶 多核苷酸激酶（ polynucleotidkinase）的功能与碱性磷酸酯酶相反，可以将磷酸集团转移到自由的5`端。在连接载体和目的DNA时，加入此酶后，反应就可顺利进行。 T4-多聚核苷酸激酶（T4-PNP） T4-PNP可在DNA、RNA的5‘-OH上加磷， 用于探针的末端同位素标记： 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4-PNP Mg2+ pppATP（g-32P-ATP） 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ 3、末端脱氧核苷酰转移酶（TdT） 不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Mg2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ TdT的基本特性： Co2+ 存在下可作用于平末端 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ AAAAAAAAAAA Thank you! 2.1 限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核苷酸内切酶。 II 型限制性核酸内切酶的主要特性 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 在识别序列内部或两侧处切断DNA 被切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ EcoR I的识别序列 粘性末端(sticky ends)：切口一般错开2个或4个核苷酸，产生的片段在末端有一条链伸出。这样的末端被称为粘性末端或亲和末端（sticky ends）. 平滑末端 (blunt ends)：限制性内切酶将DNA-链仅在识别序列的中间切开，产生了平滑末端（blunt ends）。例如PvuII（CAG↓CTG）、AluI（AG↓CT）等。 粘性末端的作用：通过电镜观察发现,环状DNA分子经限制酶切割形成的线性短片段又能够自发的重新环化起来，环化的分子经加热后又会重新线性化；但如果环化后马上用大肠杆菌DNA连接酶处理，使它们的[3‘-OH]和[5’-P]基团之间封闭起来，那么形成的环状DNA分子就是永久性的。 这种由限制酶产生的DNA粘性末端片段之间的连接可以发生在分子间和分