多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究.pdfVIP

250翌 JournalofGuangxiAgric.andBio.Science 2006年9月 Sept.,2006 文章编号:1008一3464(2006)增一0205-02 多位点基因打靶技术的鲡鱼体内实验研究 唐冬生’，高东’，蒋91，严霞’，张细权 “，陈超明3，李云3 (1佛山大学 医学院，广东佛山528000;2 华南农业大学动物科学学院，广东广州510642 3 佛山市渔业站，广东佛山528000) 摘要:在转基因动物的研究中，一般采用随机插人的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合， 严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传，是转基因动物研究巫待解决的问题。转基因定点整合技 术，即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径，但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小 组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术，并构建了用于级鱼的体内多位点基因打靶的打靶载 体，本文开展多位点基因打靶技术的级鱼体内实验研究。 以撅鱼rDNA基因 (编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列，构建含干扰素基 因的打靶载体，以其间隔序列为靶位点，针对鱼类胚胎发育特点，采用精子介导技术进行多位点基因 打靶，最终获得定点整合干扰素基因的级鱼，并建立一套适用于动物的基因定点敲人的体内基因打靶 技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法，获得级鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞，采用脂质体 介导法使多位点基因打靶载体在级鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法，利用筛选药物G418 和GCV (更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后，对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证 明了干扰素基因在级鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的 多位点基因打靶载体在级鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理，利用筛 选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗，结果成功孵化出106尾转基因级鱼鱼 苗。(4)培育6个月后，取20尾转基因缘鱼进行鉴定。采用PCR,RT-PCR、测序等方法进行定点整 合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转人的基因— 干扰素基因，其中有3尾实现了定点整合并表达。 本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中，建立一套适用于鱼类的高效、安全 的多位点基因打靶技术，并获得外源基因定点整合并表达的缘鱼。 关健词:级鱼;多位点;基因打靶;精子介导;体内实验 中图分类号:Q78 文献标识码:A ResearchofmultiplelocusgenetargetinginvivoofSiniperca TANGDong一sheng，GAODong，JIANGHong，YANXia， ZHANGXi一quanz，CHENChao一ming3，LIYun3 (1MedicalCollege，FoshanUniversity,Foshan528000,China; 2CollegeofAnimalScience，SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642，China; 3FoshanFisheryInstitute,Foshan528000,China) Abstract:Thetransgenictechniqueofrandomintegrationwasusedgenerallyinthestudyof 收稿日期:2006-08-08, 签金项目:国家自然科学荃金项目(3047097830170737);广东省自然科学基金项目 , 作者简介:唐冬生 ((1963一)，男，湖南衡阳人 佛山大学教授，博士;E-mail;tangdsh@163.com , 206 广 西 农 业 生 物 科 学 第25卷 transgenicanimals.Therandomintegration