Quantitative impurity analysis of recombinant pharmaceutical protein by immunoassay.ppt

七、免疫亲和色谱法 (affinity chromatography) 基本原理：利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法 第三节、重组蛋白药物中杂质分析 产品相关杂质 工艺相关杂质 一、宿主蛋白(HCP)残留 CHO宿主蛋白残留 ? E-coli宿主蛋白残留 ? 酵母菌宿主蛋白残留 ? HEK293宿主蛋白残留 评估HCP定量用多克隆抗体的特异性 2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱 将2D Gel上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育后进行Western Blot化学发光检测，以确认多克隆抗体能够与哪些宿主细胞蛋白结合 通过Western Blot检测结果（多抗能检测到的HCP数量）与2D膜上检测结果（总HCP数量）的比较，得出用于评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的Match Rate 二、宿主蛋白（HCP）残留检测 Cygnus??F550?CHO?HCP?ELISA?Kit 试验原理: 采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗CHO CHP多抗，免疫反应构成为夹层式结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后清洗酶标板去除未结合反应物，添加TMB底物显色，吸光值与样品中CHO宿主蛋白的含量成正相关。 检测步骤： （1）于每个反应孔中，加入100 μL抗CHO HCP多抗-HRP； （2）从标准蛋白液、对照和样品中吸取50 μL 上清加入到已标记好的反应孔中；180rpm下室温、振荡培养2h； （3）弃去孔内溶液，每孔加350 μL 洗涤液，重复洗涤4次； （4）?于每个反应孔中，加入100 μL TMB底物溶液，于室温孵育30min； （5?）于每个反应孔中，加入100 μL终止液；依序读取OD450/650 nm吸收值(空白对照孔调零)。 （6）数据处理：根据测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线，然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。 二、胰岛素原残留 对目前重组人胰岛素生产主要以E.coli表达人胰岛素原，初步纯化后变复性，经胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)协同酶切，去掉前导肽和C-肽，形成有活性的胰岛素，并进一步纯化精制而成。 上述工艺制备所得人胰岛素产品中可能残留人胰岛素原、C-肽等人胰岛素相关杂质，其残留的存在可能影响人胰岛素的药效 试验原理： 采用双单抗夹心ELISA法，在酶标板微孔条上预包被抗胰岛素原C-肽特异性抗体，样品中胰岛素原结合微孔条上的特异性抗体，然后加入HRP标记的抗胰岛素特异性抗体，用TMB底物显色，吸光值与样品中胰岛素原的含量成正相关。 操作步骤: 1、加样：加待检样品，100 μl/孔，37℃ 2 h，同上洗涤； 2、加酶标抗体：酶标抗体稀释液稀释HRP-13A4至工作浓度，100 μl/孔，37℃ 1h，同上洗涤； 3、显色和中止反应：加新鲜配制的底物100μl/孔，37℃避光作用20 min；加中止液50μl/孔终止反应，测定每孔OD450/630nm值。 4、数据处理：以标准品浓度的对数log(c)对吸光值 log(y)回归，可求得样品中人胰岛素原的残留量。 Standard curve for rhPI in PBS was determined by the immunocapture assay (n=5). 三、卡那霉素残留检测 2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低抗生素，使用抗生素种类不得超过1种，且产品后继工艺应保证可有效去除制品中抗生素，去除工艺应该验证。 （4）生产过程中使用抗生素时，成品鉴定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限制。上述的生产过程包括种子培养活化，发酵，纯化等所有的步骤，所以种子活化阶段是算在生产过程中的。 Mercodia Proinsulin ELISA kit 试验原理: 采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的含量。 Quantitative impurity analysis of recombinant pharmaceutical protein by immunoassay 第一节 重组蛋白药物中杂质概述 杂质(Impurity)：指药物在生产或贮藏过程中引入的,无治疗作用或影响药药物的稳定性和疗效,甚至对人健康有害的物质。 杂质的检测分析贯穿药物研发始终,是保障药物质量与安全的重要因素。 分类：