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基因的定位与克隆 突变体 Reveres genetics----反向遗传学 Reveres genetics Forward genetics正向遗传学 What is a mutation? 突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。 多态性(Polymorphism)－群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。 获得突变体的方法： 1.1 自发突变 （少，尤其是有重要功能的基因） 1.2 物理、化学诱变 1.3 插入突变法 ：T-DNA 插入法 ；转座子法 突变体 A list of some sequenced eukaryotic genomes 基因图位克隆（map based cloning） Gene Mapping (基因定位) 基因定位的前期条件 突变的遗传背景清楚 （单基因，显隐性等……） 突变物种有高密度遗传图谱（染色体连锁图谱），如需克隆基因还需物理图谱 遗传图谱(genetic map)，即确定基因（或遗传标记）之间的遗传学距离，用cM(centimorgen)表示 物理图谱(physical map)，即确定基因（或遗传标记）之间的绝对物理学距离，通常用Mb(百万碱基对)或Kb(千碱基对)来表示 作图群体 （F2，RI等） 遗传图谱 形态标记 遗传学上稳定、可见的外部特征 ---遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。 如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。 特点：直观简单 从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。 细胞学标记 染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等）。 随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。 特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。 人类染色体核型图 生化标记——贮藏蛋白和同工酶 贮藏蛋白 同工酶 特点：经济、方便、成本较低 结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。 分子标记 本质是以核苷酸序列作为标记，来源于DNA水平的突变。 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映不同个体的基因组DNA间的差异。 分子标记的特点 （1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。 分子标记的类型与发展 1.分子标记的类型 ①基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性）。 ②基于 PCR的分子标记，它又分为两类： RAPD （Random amplified polymorphic DNA） DAF（DNA amplification fingerprinting） SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA） 微卫星DNA（Microsatellite DNA）,又称SSR（Simple sequence repeat） ISSR（Inter simple sequence repeat） AP-PCR（Arbitrary primer PCR） 它主要有SCAR（Sequence characterized amplified region） STS (Sequence tagged site) AFLP（Amplified fragment length polymorphism） AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增 CAPS（Cleaved amplified polymorphic sequence） CAPS是先扩增，再酶切扩增片段 ③基于 DN