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杭白菊中黄酮类化合物的制备 （生命科学学院 2008生物技术 200811001153 陈美凤） 摘　要: 利用超声波助提取法从杭白菊中提取黄酮类化合物,蒸馏出提取溶剂，浓缩得浸膏，经石油醚、水饱和正丁醇萃取初步纯化后,与黄酮类化合物粗品一起进行定性测定、定量测定、功能测定，比较得到其W粗品（%）为0.235%， W纯品（%）为0.067%，黄酮类化合物粗品还原力比纯品还原力强。 关键词: 杭白菊 黄酮类化合物 定性测定 定量测定 功能测定 菊花为菊科植物，杭白菊,是我国四大名菊之一,是菊花家族中药食俱宜的品种,历史上曾享有“杭白菊与龙井茶”并提之誉,是我国传统著名出口中药材“浙八味”之一。现代药理学实验证实菊花具有降血脂、改善心血管功能、抗氧化等多种药理活性。杭白菊含有挥发油、黄酮、多糖、绿原酸等成分,其中,黄酮类被认为是主要药效成分,具有降血脂、改善心血管功能、抗氧化等作用。 菊花中的黄酮类化合物主要包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮三类,是菊花中的主要生物活性成分之一。本实验以杭白菊中的黄酮类化合物为主要对象,用超声波辅助提取技术从杭白菊中提取黄酮类化合物, 经石油醚、水饱和正丁醇萃取初步纯化后, 与黄酮类化合物粗品一起进行定性测定、定量测定、功能测定。 1 　材料与方法 1. 1 　实验仪器、材料及试剂 1.1.1 　主要仪器 紫外可见分光光度仪，旋转蒸发仪，高速粉碎机，恒温水浴锅，分液漏斗，铁架台，试管架，比色管，洗耳球，移液管，烧杯，量筒等。 1. 1. 2 　实验材料及试剂 杭白菊(购于广西师大北门凉茶摊)、正丁醇、乙酸、甲醇、乙醇、枸橼酸、盐酸、无水三氯化铝、芦丁标准品、镁粉、4%氢氧化钠、亚硝酸钠、三氯乙酸、硝酸铝、蒸馏水、邻二氮菲溶液、硫酸亚铁溶液、H2O2、PBS溶液等。 1. 2 　提取与分离纯化 电子天平称取杭白菊20g ，利用超速破碎机粉碎，过20~40目筛，按固液比1:20加40 %甲醇400ml超声波辅助提取30min，蒸镏浓缩得原料重，按1:1比例加入石油醚萃取取下层，再用正丁醇萃取取上层，得到黄酮化合物初级纯品，与黄酮类化合物粗品一起进行定性测定、定量测定、功能测定。 1.3 　定性鉴定 1.3. 1　三氯化铝反应：取样品液1ml，1%的三氯化铝乙醇溶液，3—羟基黄酮（黄酮醇）、5—羟基黄酮因与铝产生螯合物而呈鲜黄色。将样品点在纸上，喷洒该试剂，干燥后黄色斑点于紫外荧光灯下观察显明显荧光。 1.3. 2盐酸—镁粉反应：黄酮（醇），二氢黄酮（醇）在盐酸—镁粉作用下，易被氢化还原，迅速生成红~紫红色（个别有绿~兰色）。取样品液1ml于试管中加镁粉少许振荡，滴加几滴浓盐酸（1次加入），1~2 min内（必要时加热）即出现颜色。大多黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类显红~紫红色，黄酮类显橙色，异黄酮及查儿酮无变化。 1. 4 定量测定 比色法：利用黄酮类化合物结构上的酚羟基特征及其还原性进行显色，有邻二羟基或3,5位有羟基取代的黄酮可与金属离子形成黄色或橙色的络合物，这些络合物在特定波长有最大的吸收，可由此法比色进行定量。常用硝酸铝—亚硝酸钠溶液为显色剂，与黄酮类化合物生成铝络合物，在500nm处有最大的吸收。常测定的是总黄酮的量。 芦丁标准曲线的制作：精密吸取芦丁标准溶液0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml于10ml的容量瓶中，分别加入30%的乙醇使之成为5ml。，再分别加入5%亚硝酸钠0.3ml，摇匀，静置10min，再分别加入10%硝酸铝溶液0.3 ml，摇匀，静置10 min，再分别加入4%氢氧化钠溶液4 ml，再用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min，用试剂做空白对照，于510nm处测定吸光度，再以浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 样品的测定及提取液中黄酮提取率的计算：取样品液1 ml于10 ml的容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度，作为待测液。取适量稀释后的样品液代替芦丁标准液，然后按照标准曲线制备项的方法显色，于510nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试样品溶液中芦丁的浓度，在根据下面的公式计算黄酮的提取率。 W（%）=（c×V1×V2×10-3 ）/m W：黄酮的提取率（%） C：样品溶液的浓度（mg/ml） V1：供试液的体积(ml) V2：样品的稀释倍数 m：原料的质量（g） 1. 5 功能测定 还原力的测定：还原能力的测定时以样品是否是良好的电子供应者为指标的。如果样品是良好的电子供体，其供应的电子不仅可以使Fe3+还原成Fe2+，还可以与自由基结合形成惰性的物质，从而达到中断自氧化链锁反应的目的。在15ml的离心管中依次加入pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5ml，不同浓度的样品液2.5ml和1%的铁氰化钾溶液2