毕业论文实验步骤.docVIP

5.1.1实验过程 5.1.1.1SM-GA-BSA抗原的制备 5.1.1.1.1SM与BSA的初始比对偶联效果的影响 1、pH9.6的碳酸盐缓冲液的配制；称取碳酸钠10.2g及碳酸氢钠16.8g溶于双蒸水中定容至6000ml；4℃ 冰箱保存备用； 2、称取五组200mgBSA分别溶于50mlpH9.6的碳酸盐缓冲液中，获得A、B、C、D、E溶液； 3、分别称取50mg、100mg、200mg、400mg、800mg链霉素，并将其分别溶于50mlpH9.6的碳酸盐缓冲液中，获得a、b、c、d、e溶液； 4、将Aa、Bb、Cc、Dd、Ee混合，再分别向五组中缓慢加入0.2mL25%的戊二醛，边加边搅拌。； 5、将加入戊二醛后的五组溶液置于室温下搅拌反应6h； 6、0.01mol/L、pH7.4PBS缓冲液的配制；称取8.0g NaCl、0.1g KCl、2.9g Na2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4,加双蒸水溶解，定容至1000mL，4℃ 冰箱保存备用； 7、反应完后用pH7.4的PBS缓冲液透析1d； 8、透析完后对每组进行SDS凝胶电泳，看偶联是否成功； 9、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描； 10、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定链霉素与BSA的最佳初始量x。 5.1.1.1.2戊二醛的量对偶联效果的影响 1、称取五组链霉素与BSA（第一组实验的最佳初始量x）分别溶于碳酸盐缓冲液中，获得A′、B′、C′、D′、E′溶液； 2、向每组分别缓慢加入0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL25%戊二醛，边加边搅拌，获得a′、b′、c′、d′、e′溶液，将其置于室温下搅拌反应6h； 3、反应完后用pH7.4的PBS缓冲液透析1d； 4、透析完后对每组进行SDS凝胶电泳，看偶联是否成功； 5、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描； 6、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定戊二醛的最佳加入量y。 5.1.1.1.3偶联时间对偶联效果的影响 1、称取五组一定质量的链霉素、BSA（第一组实验的最佳初始量x），并将其溶于100mL的碳酸盐缓冲液中； 2、分别向五个组中加入一定量的戊二醛（第二组实验的最佳加入量y），边加边搅拌； 3、将五个组置于室温下，分别搅拌反应2h、4h、6h、8h、10h； 4、待每组反应完后，用pH7.4PBS缓冲液透析1d； 5、透析完后对每组进行SDS凝胶电泳，看偶联是否成功； 6、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描； 7、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定最佳反应时间t。 5.1.1.2链霉素-GA-OVA包被原的制备 其方法与SM-GA-BSA抗原的制备相同。 5.1.1.3根据以上三组实验，利用正交法分析出链霉素在用戊二醛合成抗原时的最优条件 1、根据上述三组实验的x，y，t对应分别设置三个变量； 2、对链霉素与戊二醛的初始比变量进行设置，x-1、x、x+1； 3、对戊二醛的量进行设置，y-0.1、y、y+0.1； 4、对偶联时间进行设置，t-2、t、t+2； 5、设计三因素三水平的正交试验； 6、对正交实验结果进行方差分析、F检验，确定出最优偶联条件。 5.1.1.4对不同偶联条件下的偶联液进行SDS凝胶电泳： 1.各种溶液配制： ①30%丙烯酰胺：准确称取29g丙烯酰胺和0.8 g 双丙烯酰胺溶于60mL双蒸水中，于37℃溶解，然后补双蒸水至100mL，棕色瓶4℃保存 ②浓缩胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl，pH6.8)：6.06gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水加至50mL，4℃保存 ③分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8):9.08gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水加至50mL，4℃保存 ④10%SDS：25gSDS，用双蒸水溶解至250mL。室温保存 ⑤10%过硫酸铵(5ml)：0.5 g过硫酸铵溶解于5ml 双蒸水，可在密封的管内，4℃存放数月 ⑥4ｘ分离胶缓冲液(100ml):75ml 1.5mol/l Tris-HCl(pH 8.8),4ml 10% SDS,21ml 蒸馏水,可在4℃存放数月 ⑦4ｘ堆积胶（浓缩胶）缓冲液(100 ml):50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),4ml 10% SDS,46ml 蒸馏水,可在4℃存放数月 ⑧电泳缓冲液(1L):3g Tris 碱,14.4g 甘氨酸,1g SDS,加蒸馏水至1L,pH 应该在8.