第10章酶的作用机制9.docVIP

第十章 酶的作用机制 P384 酶的活性部位 （1）酶活性部位：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，活性部位又称活性中心。 酶分子中与酶活力直接相关的区域称为活性中心，分为： 结合部位：负责与底物结合，决定酶的专一性。 催化部位：负责催化底物键的断裂或形成，决定酶的催化能力。 对需要辅酶的酶，辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往是酶活性部位组成部分。 （2）酶活性部位特点： 1. 活性部位只占酶分子中相当小的部分，通常1~2%。P384 表10-1列举一些酶活性部位的氨基酸残基。如溶菌酶一共129个氨基酸残基，活性部位为Asp52和Glu35；胰凝乳蛋白酶241个残基，活性部位为His57，Asp102，Ser 195。 2. 活性部位为三维实体。活性部位氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，甚至不在一条肽链上，但在空间结构上相互靠近。因此空间结构破坏酶即失活。活性中心以外部分可为酶活性中心提供三维结构。 3. 酶与底物的结构互补是指在酶和底物结合过程中，相互构象发生一定变化后才互补。如P385 图10-1。 4. 活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内。裂缝中为一个疏水微环境，也含有某些极性氨基酸残基有利于催化，底物在此裂缝内有效浓度很高。 5. 酶与底物结合形成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。 6. 酶活性部位具有柔性和可运动性。 研究酶活性部位的方法 酶侧链基团化学修饰法： 特异性共价修饰：如二异丙基磷酰氟（DFP）专一地与酶活性部位Ser-OH的羟基共价结合，使酶失活。如胰凝乳蛋白酶共28个Ser，但DFP只与活性中心的Ser反应，见P386。反应后，用HCl将酶部分水解，得含二异丙基磷酸酯（DIP）基团的肽的片断，序列分析定出DIP-Ser为Ser195。 亲和标记：用与底物结构相似的修饰剂，对酶活性部位进行专一性共价修饰。 如TPCK（结构式见P387），结构与胰凝乳蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸乙酯（TPE）类似，TPCK只与胰凝乳蛋白酶中His57结合，说明His57为该酶活性部位的一个氨基酸残基。 （2） X-射线晶体结构分析： 可提供酶分子三维结构，了解酶活性部位氨基酸残基所处相对位置与状态，与底物结合后酶分子在底物周围氨基酸残基排列状况，被作用键周围残基状况等。由此提出活性中心处氨基酸残基组成及催化作用形式。 如溶菌酶：对它水解的糖苷键周围氨基酸残基分析后确定酶的催化基团为Glu35和Asp52。 又如胰凝乳蛋白酶经X-射线晶体结构分析，表明活性部位由Ser195、His57和Asp102组成，并提出这三个氨基酸残基联在一起形成一个“电荷中继网”，如P409 图10-40所示： ① 没有底物时，His57未质子化，三联体排列为A；② 在加上底物后，Ser195转移一个质子给His57，带正电荷的咪唑环通过带负电荷的Asp102静电相互作用被稳定，成为B。详细酶作用机制见P410 图10-42。 影响酶催化效率的有关因素： 底物和酶的邻近效应与定向效应。 酶催化反应高效率一重要原因是将分子间反应变为分子内反应。 邻近效应：底物与酶先形成中间体络合物，两分子成一个分子，分子内反应速度比分子间反应速度提高。P388 图10-2 所示：用咪唑催化乙酸对硝基苯酯水解来证实：咪唑可催化乙酸对硝基苯酯的酯键水解成乙酸和对硝基苯酚；若将咪唑分子先共价连接在底物上，在分子内催化酯键水解，可增速24倍。 定向效应：底物反应基团和酶催化基团正确取位会大大加速反应。P389 表10-3 用二羧酸单苯酯水解相对速度和结构关系实验表明：分子内催化反应，当催化基团羧基与酯键愈邻近并有一定取向，反应速度愈大。每移去一个旋转自由度，反应速度约增加200倍。 又如P389所示制备邻羟苯丙酸内酯的分子内酯化反应表明：当在分子中引入甲基使羧基和酚羟基定位，反应速率可提高2.5×1011倍。 底物的形变和诱导契合： 酶使底物分子内敏感键中某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，底物扭曲而接近过渡态，使反应加速。 如具有五元环构象的乙烯环磷酸酯（P390），由于构象更接近磷酸酯水解时的过渡态，P-O键有电子张力，因此水解速度是磷酸二甲酯的108倍。 溶菌酶作用细菌细胞壁，水解由N-乙酰基葡萄糖胺等构成的糖苷键。溶菌酶与底物结合时会引起糖环构象由椅式变成半椅式，可加速水解。 酸碱催化： 酶为广义酸碱催化。咪唑基既是一个强亲核基团，又是一个有效的广义酸碱催化功能基团，因此蛋白质中His含量虽少，但却占有重要的地位。此外酶蛋白中还有氨基、羧基、巯基、羟基等，都具有广义酸碱催化功能。 共价催化： 有亲核催化或亲电催化。酶在催化过程中形成中间物，P392