几丁质酶抑制化合物产生菌的筛选初探论文.docVIP

　　几丁质酶抑制化合物产生菌的筛选初探论文 谢洁 周泽扬 张新军 蓝希钳 胡军华 【关键词】 几丁质酶；,抑制化合物；,产生菌 摘要： 从采自全国的200多份土样中分离出1350多株菌，利用平板透明圈法和铁氰化钾方法，以家蚕中肠几丁质酶作为靶标，从这些菌株中筛选出家蚕几丁质酶抑制化合物的产生菌1237#，经初步鉴定该菌株为假单胞菌。本文主要介绍几丁质酶抑制化合物筛选体系的建立、活性物质性质的初步探索及目的菌株的鉴定。 关键词： 几丁质酶； 抑制化合物； 产生菌 Preliminary screening of chitinase inhibitor producing strains ABSTRACT In the course of screening for ne chitinase as a target, and transparent inhibition zone plate assay and potassium ferricyanide method, a strain belonging to the Pseudomonas, named#1237 ong 1350 strains from 200 soil samples. The screening procedure and the preliminary study of the culture idin［2］、 Argifin［3］、Argadin［3］、Demetyallosamidin［4］等。长期以来日本等国一直在进行几丁质酶抑制化合物的研究，但国内至今未见与几丁质酶抑制化合物相关的研究报告。本研究旨在从我国丰富的微生物资源中获得具有自主知识产权的新型几丁质酶抑制化合物及其生产菌株，为开发具有新型作用点的杀虫抗真菌药物奠定基础。 1 材料与方法 1.1 培养基 1.1.1 平板培养基 PDA培养基。 1.1.2 液体培养基(%) 葡萄糖1，蛋白胨02，牛肉膏01，酵母提取物01，Fe2(SO4)3 0001，pH72。 1.1.3 几丁质酶抑制化合物的筛选平板(%) MgSO4 005，KH2PO4 005，KCl 005，FeSO4 7H2O 001，ZnSO4 7H2O 01，胶体几丁质1，琼脂粉12，pH72。 1.2 几丁质酶粗酶 提取家蚕初蛹中肠液，经硫酸铵盐析、透析后冻干保存备用；几丁质由日本信州大学下板诚教授赠送；胶体几丁质：利用盐酸处理几丁质制备［5］。 1.3 活性菌株的液体培养方法菌体接种于液体培养基，37℃振荡培养6d，培养液8000r/min离心10min，取上清检测活性。 1.4 几丁质酶抑制物的检测方法 1.4.1 平板透明圈法 将几丁质粗酶配成01g/ml的几丁质粗酶液(以后提到的酶液均是按此法配成)，把酶液与筛选菌株培养液按1∶2的比例混合，在几丁质酶抑制化合物筛选平板上打孔，取混合液50μl加样于孔中，观察平板透明圈的大小。在检测过程中以蒸馏水、缓冲液和液体培养基作为空白对照。几丁质酶抑制化合物筛选平板含有胶体几丁质和无机盐。在平板上打孔加入酶液，几丁质酶能分解平板中的胶体几丁质而产生透明圈。用相同量的酶液与检测液混合时，透明圈变小表明酶的活性受到抑制，透明圈越小表明受抑制的程度越高。这种方法能够直观、快捷地筛选出几丁质酶抑制化合物。 1.4.2 铁氰化钾方法［7］500μl胶体几丁质加入100μl酶液、不同测试培养液或对照液和pH72磷酸盐缓冲液(测试液体与缓冲液总体积为1000μl)，37℃反应30min，加入2ml糖显色液，沸水浴15min终止反应，离心，冷却后测上清的A420(糖显色液用05mol/L的Na2CO3配制成137 μmol/L的铁氰化钾溶液)。测试组1 500μl胶体几丁质加入100μl酶液和1000μl pH72磷酸盐缓冲液，在37℃进行正常酶促反应30min后进行测定。对照1(C1) 500μl胶体几丁质加入100μl酶液和1000μl pH72磷酸盐缓冲液，加样后立即沸水浴15min灭活酶，再置于37℃保温30min和其他组一起测定。测试组2 500μl胶体几丁质加入100μl酶液、100μl培养液和900μl pH72磷酸盐缓冲液，在37℃进行正常酶促反应30min后进行测定。对照2(C2) 500μl胶体几丁质加入100μl酶液、100μl培养液和900μl pH72磷酸盐缓冲液，加样后立即灭活，再置于37℃保温30min和其他组一起测定。测试组1与对照组1的吸光值的差值为ΔAbs1，测试组2与对照组2的差值为ΔAbs2。测定后按以下公式计算几丁质酶活性：酶活性(U/ml)=ΔAbs×1000×1000 215.61×反应时间(min)×反应体系