15神经生物学研究的常用方法.pdfVIP

1.神经生物学研究的常用方法 神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。总体上，神经生物学的研究 方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子 生物学方法及脑成像技术。 7.1 形态学方法 神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其 他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。 7.1.1 束路追踪法 追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经 系统的发育和成熟都具有重要意义。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺 行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃 变）研究。20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。 20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显 示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP ）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在 脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP 的积累 。不久LaVail正式使用HRP作为 轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。HRP可被神经末梢、胞体和树突吸 收，轴突损伤部分也可摄入。在胞体内，HRP 的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈 阳性反应而显现出来。被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。 除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。 7.1.2 免疫组织化学 免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜 表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速， 应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆 抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许 多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。 组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗 原注入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血 清中提取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切 片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合。常用的荧光素是异 硫氰酸荧光素（FITC ）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC ），在荧光显微镜下可观察荧光抗 体抗原复合物。常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取 的），它的底物是3，3 －二氨基、联苯胺（DAB ）和H O ,HRP 使DAB 氧化形成棕黄色产 2 2 物，可在光镜和电镜下观察。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜 下观察。 标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的 抗原直接结合。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一 抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称 二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记 二抗复合物。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感 度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一 种称之为过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidase complex method,PAS 法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP 标记的抗酶抗体，即以HRP 作为 抗原免疫动物，制成抗HRP 抗体，再以HRP 标记该抗体制成由3 个酶分子与2 个抗酶抗体 组成的相当稳定的环形 PAP 复合物。标本先后以一抗、二抗和 PAP 复合物处理后，再以 DAB 显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶 分子结合，因此敏感性很强。免疫组织化学术近10 年来又有新进展，如生物素－亲合素等 新颖试剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin ）又称维生 素 H ，是从卵黄和肝中提取的一种