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　　利用同尾酶技术构建pET15b论文 姚玲玲， 王家宁， 黄永章， 郭凌郧 摘 要 目的: 利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒，为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物，用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板，特异性扩增CAT 全长cDNA。将扩增的CAT cDNA 与dATP 反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加A并纯化，然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中.freelHⅠ双酶切，利用同尾酶（SalⅠ与XhoⅠ，BglⅡ与BamHⅠ）能酶切产生相同黏性末端的特性，将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连，构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT，经PCR及酶切鉴定，并通过核苷酸序列测序证实。 结果: 获得pET15b-PEP-1-CAT重组子，经测序分析证实，克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致，CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。 结论: pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白His tag-PEP -1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。 关键词 同尾酶;过氧化氢酶;TA克隆;DNA重组;PEP-1肽 Abstract:Objective To construct the rebinant plasmid pET15b- PEP-1-CAT er technique and provide a vector expressing PEP-1-CAT fusion protein for the prevention and therapy of myocardial ischemia-reprefusion injury.Method Using pfu DNA polymerase,the full-length human catalase cDNA plified via PCR from pZeoSV2(+)-CAT plasmid. The PCR product plate-independent terminal transferase activity of Taq DNA polymerase. The purified products of CAT cDNA ed into DH5α. The correct rebinant ed after pGEM-T-CAT.Tid e digested and named after pET15b-PEP-1. pET15b-PEP-1 and pGEM-T-CAT HI and SalI-BglⅡ,respectively. The purified linear fragment of pET15b-PEP-1 and the purified CAT cDNA fragment ers id id ed that the PEP-1 and the human CAT cDNA sequence of pET15b- PEP-1-CAT by sequencing an catalase cDNA sequence of GeneBankAY028632, respectively. The pET15b-PEP-1-CAT of prokaryotic expression plasmid id provides a basis for production of His tag-PEP-1-CAT fusion protein to prevent and treat myocardial ischemia reperfusion injury. Key arker）为北京华美生物工程有限公司产品。PCR引物及PEP-1的寡核苷酸链由赛百盛公司合成。 1．1．3质粒与菌株:模板质粒pZeoSV2(+)-CAT由美国西奈山医学院生化/药理学系白景香博士惠赠；质粒pET15b购自Novagen公司；pGEM-T Easy载体系统为Promega公司产品；大肠杆菌DH5α为本室保存。 1．2方法 1．2．1 pET15b-PEP-1-CAT构建流程图（图1） 1．2．2 PCR扩增目的片段:根据GeneBank中登录号为“AY028632”的人CAT cDNA设计合成CAT的引物，两端分别直接引入SalⅠ、BglⅡ酶切位点：上游引物：5′SalⅠ GTCG