前列腺精子结合蛋白的二维凝胶电泳及质谱分析论文.docVIP

　　前列腺精子结合蛋白的二维凝胶电泳及质谱分析论文 【摘要】 【目的】 应用精子膜蛋白亲和层析柱分离金黄地鼠前列腺精子结合蛋白，并用二维电泳和质谱对金黄地鼠前列腺精子膜结合蛋白进行初步分析。【方法】 应用附睾精子膜亲和层析柱纯化前列腺精子结合蛋白,采用二维凝胶电泳对纯化的前列腺精子膜结合蛋白进行蛋白分离和图像分析，并结合基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析及数据库搜索从而鉴定部分蛋白质斑点; RT-PCR检测已鉴定蛋白在前列腺及未受精卵子中的mRNA的表达。 【结果】 附睾精子膜蛋白亲和层析柱可纯化出前列腺结合蛋白，前列腺附睾精子膜蛋白结合蛋白的二维凝胶电泳蛋白图谱。分离的蛋白质斑点为30个，质谱鉴定出2个蛋白点，一为热休克蛋白105，另一羰基还原酶（NADPH）-3。前列腺和未受精卵中均表达热休克蛋白105和羰基还原酶-3的mRNA。 【结论】 自前列腺分泌物中分离出精子膜结合蛋白，金黄地鼠前列腺中精子结合蛋白经双向电泳及飞行质谱分析鉴定出蛋白热休克蛋白和羰基还原酶。 【关键词】 前列腺分泌蛋白; 附睾精子膜蛋白; 二维凝胶电泳; 质谱 Abstract: 【Objective】 The aims of this study binding proteins and analyze the ventral prostate sperm binding proteins by 2D- electrophoresis and MOTIF. 【Methods】 The ventral prostate secretory sperm binding proteins al sperm membrane affinity chromatography. The protein spots excised from 2D gels ass fingerprinting feature by database searching. The mRNA of heat shock protein-105 and carbonyl reductase（NADPH）-3 membrane proteins from ventral prostate secretory proteins. About 30 spots ventral prostate sperm binding proteins. Both mRNA of heat shock protein-105 and carbonyl reductase （NADPH）-3 . Heat shock protein-105 and carbonyl reductase （NADPH）-3 are identified from the ventral prostate secretory sperm binding proteins. Key al sperm membrane protein; 2D-electrophoresis; mass spectometry 前列腺为雄性附属性腺之一.freela (USA) 公司。 胰酶(typsin)购自美国Promega公司。等电聚焦所用的固定pH梯度胶条(immobilized pH gradient strip, IPG strip)、再水化液、覆盖液、2-D Clean-Up试剂盒均为英国Amerchan公司产品。双向电泳在Ettan IPGphor Ⅱ IEF System 和Ettan DALT t (英国Amerchan公司)的装置上进行。飞行质谱分析采用Voyager-DETM STR (PE Biosystems, USA)质谱仪分析。 1.1.3 附睾精子膜蛋白制备 附睾精子收集, 4只健康14~20周龄雄鼠用致死量的4％戊巴比妥钠麻醉后，切开腹腔，暴露并游离附睾；用含5 mmol/L HEPES/0.264 mmol/L蔗糖缓冲液 pH 7.4，含2 mmol/L苯甲基磺酰氟 (PMSF) 和 10 mmol/L 碘乙酰胺的注射器21号磨平针头，经输精管逆行冲出精子。冲出精子经PBS (pH 7.4,含 2 mmol/L PMSF和10 mmol/L碘乙酰胺)洗3次 (每次在4 ℃条件下600 × g离心5 min)。重悬于0.5% NP-40蔗糖缓冲液中, 调整精子浓度为2×106/mL，置于冰上20 min。然后在0 ℃，10 000 × g下离心15 min，收集上清即为膜蛋白，经超滤膜浓缩后(Centricon-3，美国Amicon公司)定量蛋白。 1.1.4 前列腺分泌物的收集 将6只14周龄金黄地鼠的前列腺(VPG)分离。 腺体表面切几个口，置自制不锈钢滤网上，离心收集分泌物于离心管内