大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案.docVIP

鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验 实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯 琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。 1 病料采集 1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。 1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。 1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。 2 菌的分离培养及鉴定 2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，　蛋白胨水蛋白胨(或胰蛋白胨)20g氯化钠5g蒸馏水1000mL pH7.4革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色以无菌操作的方法，2O h的新鲜菌落,光滑、砖红色的单个菌落将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；番红染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果：经镜检可见到革兰氏阴性，两端钝圆，短小杆菌，偶有2～3个菌体相连，无芽孢生化鉴定?b、甲基红（MR）试验 取可疑菌接种葡萄糖蛋白胨水，37℃培养2～3d，加入甲基红试剂两滴，立即观察结果，红色者为阳性，黄色者为阴性。 c．吲哚试验 取可疑菌接种至蛋白胨水培养基中，37℃培养2～3d。先加入3-4滴乙醚，塞紧棉塞振摇试管，使乙醚与培养液充分混匀，静置试管架上片刻，待乙醚浮于液面上层时，沿管壁加入吲哚试剂2～3滴，在接触面呈红色者即为阳性反应。 d．VP试验 取可疑菌接种葡萄糖蛋白胨水，37℃培养2～3d，加入VP指示剂，混匀后观察结果，呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。 结果鉴定：a.糖发酵试验，大肠杆菌能利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，而蔗糖则不被利用。 b.甲基红试验：阳性。 c.吲哚试验：阳性。 d.VP试验：阴性。 2.6 菌的增殖培养 挑取普通琼脂平板中表面生长光滑、边缘整齐、灰白色、半透明的单个微隆起小菌落，划线接种于普通肉汤中，在37℃恒温培养24h[5]。 结果鉴定：肉汤呈均匀浑浊，管底有灰白色沉淀，并有粪臭味24h的肉汤培养物，用灭菌生理盐水作10倍稀释，取0.2mL滴加在普通琼脂平板培养基上，用灭菌棒涂匀，平板置室温下干燥3～5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，等距离放置纸片；置35℃恒温箱内倒置培养18h后，观察结果。 结果鉴定：抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。 抑菌圈直径（毫米） 敏感度： 20以上 极敏 15～20 高敏 10～15 中敏 10以下 低敏 0 不敏