H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达和表达产物的反应原性.PDFVIP

江苏农业科学　２０１６年第４４卷第１０期 — ４９— 董　斌，陈海超，杨　伦，等．Ｈ７亚型禽流感病毒ＨＡ基因的原核表达及表达产物的反应原性分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（１０）：４９－５２． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．１０．０１１ Ｈ７亚型禽流感病毒ＨＡ基因的原核表达 及表达产物的反应原性分析 １ １ １ １ １ １ １ １ ２，３ １，２，４ 董　斌 ，陈海超 ，杨　伦 ，耿文学 ，熊晓妍 ，孙兴臣 ，李敏婕 ，陈　闻 ，蒋家森 ，许家荣 （１．南京农业大学，江苏南京２１００９５；２．南京千里光生物技术有限公司，江苏南京２１００９５； ３．江苏省句容市科兴养殖基地，江苏句容２１２４００；４．句容市浩源农业科技有限公司，江苏句容２１２４００） 　　摘要：为构建新型Ｈ７亚型禽流感ＨＡ基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。从ＮＣＢＩ数据库下载Ｈ７ 亚型禽流感ＨＡ全基因序列，合成ＨＡ基因；定向克隆到原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）的多克隆位点中，构建重组原核 表达质粒 ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＨＡ；转化入大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中经 ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法鉴定。结果显示，重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确；重组的ＨＡ融合蛋白约为８４ｋｕ，大小 与预期融合蛋白大小一致；重组ＨＡ融合蛋白可以与Ｈｉｓ标签单克隆抗体特异性结合，与Ｈ７阳性血清有较强的反应 原性。成功构建了ＨＡ基因原核表达载体，并在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得重组ＨＡ融合蛋白表达。 　　关键词：Ｈ７Ｎ９禽流感病毒；ＨＡ基因；ｐＥＴ３２ａ（＋）；原核表达；反应原性分析 　　中图分类号：Ｓ８５２．６５　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１６）１０－００４９－０４ 　　Ｈ７Ｎ９型禽流感病毒感染人事件于２０１３年３月底在华东 病毒的受体结合位点获得了部分人流感病毒特征的突变，病 地区（上海和安徽２地）率先发生，感染以迅速进展的肺炎、 毒再感染人后获得了关键氨基酸位点的适应性突变，这可能 ［２］ 呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征（ＡＲＤＳ）和致死性转归为特 与该病毒对人的感染和致死能力有关 。尚未证实此类病 ［１］ ［３］ 点 。目前，已经在鸡、鸽子中检测到Ｈ７Ｎ９型禽流感病毒， 毒是否具有人传染人的特性，但已有家族式感染的报道 ， 但这些家禽不表现明显的临床症状。陈化兰团队在《科学通 到目前已有数名患者抢救无效死亡。 报》的最新研究显示，近期在我国导致人感染的新型Ｈ７Ｎ９流 禽流感病毒在生物分类学上属正黏病毒科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉ ［４－５］ 感病毒与同一时期存在于活禽市场上的Ｈ７Ｎ９流感病毒高度 ｒｉｄａｅ）Ａ型流感病毒属（ＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＡ） 。Ａ型流感病毒 同源；该新型Ｈ７Ｎ９流感病毒是不同来源病毒的重组病毒，它 基因组为８个节段的单股负链 ＲＮＡ，编码 １１种功能蛋白。 的６个内部基因来源于Ｈ９Ｎ２禽流感病毒，ＨＡ基因来源于浙 病毒基因组分节段的特性使流感病毒容易发生基因重排。Ａ 江鸭Ｈ７Ｎ３，ＮＡ基因来自韩国野生鸟类携带的Ｈ７Ｎ９；Ｈ７Ｎ９ 型流感病毒呈多形性，多为球形，然而新