第3章 细胞培养的必备设施、常用器材和培养基.ppt

第3章 细胞培养的必备设施、常用器材和培养基 主要内容: 细胞培养的必备设施 细胞培养常用器材及处理方法 常用溶液、培养液及其配制 第一节 细胞培养的必备设施 一、无菌实验室 防止微生物污染和有害因素的影响 工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。 二、超净台 三、恒温培养箱 恒温培养箱 CO2培养箱 四、其他设备 倒置显微镜 电热鼓风干燥箱 电子天平 恒温水浴箱 离心机 压力蒸汽消毒器 冰箱 第二节 细胞培养常用器材及处理方法 一、玻璃器材 培养皿 滴流瓶 刻读吸管、离心管等 培养瓶 烧杯、量筒等 三角烧瓶 玻璃器材的消毒处理方法 清洁液浸泡，自来水冲10次，单蒸水洗2次，培养瓶再用三蒸水浸泡过夜，烘干，包装，灭菌 二、塑料器材 多孔培养板 培养皿 培养瓶 塑料器材的消毒处理方法 用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜（单用或交叉处理）-水洗10次-单蒸水2次-三蒸水浸泡过夜-烘干-紫外线或辐射灭菌 三、橡皮器材 橡皮制品(最好是硅制品)主要是各种瓶或试管的塞子、盖子。 橡皮器材的消毒处理方法 5%NaOH煮-水洗-4%盐酸煮-水洗8~10次??-单蒸水洗三次、二蒸水洗一次。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等 金属器材的消毒处理方法 纸擦去表面的油脂-洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟-水洗-95%酒精纱布擦干-包装灭菌 五、其他物品 纱布 注射器和针头 第三节 常用溶液、培养液及其配制 一、平衡盐溶液 细胞培养中常用的基本液体。 （一）配液时的注意事项 1）称量要准确 2）物质的纯度 3）物质的可溶性 4）物质的不稳定性 5）贮存液 （二)几种常用溶液的配制方法 1、无钙、镁离子溶液 2、磷酸盐缓冲液 3、Hanks液 1、无钙、镁离子溶液(1000ml) 氯化钠(NaCl) 8g 磷酸二氢钠 0.05g 氯化钾(KCl) 0.2g 碳酸氢钠 1g 柠檬酸三钠 葡萄糖1g 加去离子水或双蒸水至1000mL 2、磷酸盐缓冲液 甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 磷酸氢二钠(无水) 28.4g 氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL 乙液：0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液 磷酸二氢钠(无水) 2.4g 氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL 甲、乙液于4℃保存，使用时按比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。 3、Hanks液 (1)母液甲(20x)配法 ① NaCl(A.R) 160g，KCl(A.R) 8g， MgSO4.7H2O（A.R) 2g，MgCl.6H2O(A.R) 2g，依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。 ②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌（此液应单配，单溶）。 待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。 (2)母液乙(20×)配法 ① Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g，KH2PO4(A.R) 1.20g，葡萄糖(A.R) 20.0g溶于800ml双蒸水中。 ②0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01N NaOH 11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4℃保存。 待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至 1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存 (3)使用液（1×）配法 取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115℃高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)，置室温后4℃保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。 二、其他溶液 （一）pH调节液 （二）消化液 （三）抗生素溶液 （四）0.5%台盼兰(Trypan blue)液 （五）0.1%结晶紫 三、培养基（维持液、营养液） (一)天然培养基(组成=平衡盐溶液+天然动物成分) 1、血清（马、兔、鸡、小牛、新生小牛和胎牛） （1）收集与保存 （2）小牛血清对细胞的作用 提供细胞增殖所必须的生长因子（A因子促进；B、C因子对细胞有抑制生长作用；D因子促进细胞粘连） 对细胞附壁有利 保护作用，解除毒性物质对细胞的毒性作用；免受冻存，搅拌，损伤 其他：利于染色体分布 （3）影响血清作用的因素 年龄；血型（ABA或O）；血色素；胆红质；脂肪酸；红细胞生成素；肿瘤患者血清；浓度；支原体污染 2、水解乳蛋白(hydrolytic albumin) 乳蛋白经蛋白酶和肽酶混合物水解而得的制品，常用浓度为0.2%～0.5%，用平衡盐溶液配制。0.4%浓度的水解乳蛋白经分解后几乎与人血浆中氨基酸成分相当。 3、酵母浸出