反转录聚合酶链反应对Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的检测论文.docVIP

　　反转录聚合酶链反应对Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的检测论文 .freelerase Chain Reaction，RT-PCR）检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的应用。方法 40例行根治性手术的Dukes A、B期大肠癌患者，应用RT-PCR法检测切除的492个淋巴结中细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）20 mRNA的表达；另取2例Dukes C期大肠癌的8个HE染色阳性淋巴结作为阳性对照，2例良性胃肠道疾病的15个淋巴结作为阴性对照；并采用系列稀释试验检测本法的敏感性。 结果 40例Dukes A、B期大肠癌患者的492个淋巴结中有17例的53个检测到CK20 mRNA的表达；2例Dukes C期大肠癌的8个HE染色阳性淋巴结RT-PCR结果均为阳性，2例良性胃肠道疾病的15个淋巴结RT-PCR结果均为阴性。系列稀释试验提示CK20 RT-PCR的敏感性为105个正常淋巴细胞中检测到1个肿瘤细胞存在。结论 CK20 RT-PCR是检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移灵敏而又特异的方法。 【关键词】 大肠肿瘤；淋巴转移；微转移；基因诊断；反转录聚合酶链反应；角蛋白20 【Abstract】 Objective This study plication of reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect lymph nodes micrometastases in Dukes A and B colorectal cancer patients.Methods DNA合成仪合成，序列如下： CK20 Sense Primer：5’-CAG ACA CAC GGT GAA CTA TGG-3’ Antisense Primer：5’-GAT CAG CTT CCA CTG TTA GAC G-3’ GAPDH Sense Primer：5’-ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG- 3’ Antisense Primer：5’-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-5 1.2.3 反转录合成cDNA和PCR反应 本实验采用Access RT-PCR试剂盒（Promega），反转录和PCR在同一试管、单一缓冲液中完成。每个RNA样品分别用CK20和GAPDH引物进行RT-PCR反应，步骤如下：在0.5ml离心管中依次加入无RNA酶的水，5×缓冲液5μl（终浓度为1×），dNTP 0.5μl（终浓度0.2mM），CK20或GAPDH的上游和下游引物各0.5μl（终浓度1μM），25mM MgSO4 1μl（终浓度1mM），AMV反转录酶、Tfl DNA合成酶各0.5μl（终浓度0.1U/μl）和1μg总RNA，整个反应体系25μl，加样过程在冰上进行。加样完成后，轻微振荡混匀，放入PTC-100TM热循环仪（MJ Research）。首先48℃ 45min进行反转录（cDNA第一链合成），然后94℃ 2min使AMV酶失活并使RNA/cDNA/引物变性，以后按以下条件合成cDNA第二链和进行PCR扩增。CK20引物存在时反应条件为94℃ 1min、62℃ 2min、68℃ 2min共40次循环；GAPDH引物存在时为94℃ 1min、63℃ 1min、68℃ 2min共30次循环，最后68℃ 7min。CK20和GAPDH扩增的终产物长度分别为370bp和626bp。同时用不加RNA的反应体系进行PCR扩增作为空白对照；不加AMV反转录酶进行PCR扩增排除基因组DNA的污染。 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 取10μl RT-PCR产物在含05μl/ml溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳后的凝胶由Floruo-S Multi Image全自动图象分析仪（BIO RAD）扫描并打印成像。 1.2.5 测序 RT-PCR产物应用ABI PTISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit pliTaq DNA Polymerase，FS (Perkin Elmer)，经ABI PTISMTM 377XL DNA测序仪检测序列。 1.3 敏感性检测 系列稀释试验。 1.3.1 肿瘤单细胞悬液的制备 肿瘤细胞来自一69岁女性盲肠癌患者，术后病理为高分化腺癌。手术标本取下后立即用生理盐水冲洗干净，剪除脂肪等非肿瘤组织，无菌情况下剪成1mm3的碎块；加入终浓度为0.1%胶原酶、001%透明质酸酶和0.02%DNA酶，4℃消化过夜；消化后的悬液用100目尼