含有非甲基化CpG的双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响论文.docVIP

　　含有非甲基化CpG的双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响论文 安蔚，赵苗青，李雅林，李松，康莉，宋文刚 【关键词】 甲基化 Stimulatory effect of bifidobacteria DNA containing unmethylated CpG motifs on maturation of bone marroethylated CpG motifs (CpG DNA) on the maturation of bone marroic DNA of bifidobacteria ethylated degree of CpG motifs etry. The levels of IL6, IL12(p40) and TNFα olecules, significantly increased the secretion of IL6, IL12 (p40) and TNFα and significantly enhanced the pro liferation of allogenic and homogenic T cells. CONCLUSION: Bifidobacteria DNA has remarkable stimulatory effects on BMDC maturation and antigenpresenting function. 【Keyice 【摘要】 目的： 探讨双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)成熟的影响. 方法： 纯化提取双歧杆菌DNA，并鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度；FACS检测BMDC的吞噬功能和表面标志分子，ELISA法检测BMDC分泌细胞因子水平.freelarroega 公司，LPS, 小牛胸腺DNA (Calf thymus DNA,CT DNA), DextranFITC购自Sigma公司，溶菌酶、限制性内切酶HpaⅡ购自中国医学科学院友谊公司，小鼠IL6, IL12(p40), TNFαELISA检测试剂盒购自R＆D公司，RPMI 1640完全培养基RPMI 1640（Hyclone公司）, 100 mL/L胎牛血清（Hyclone公司）组成，4℃保存备用；3HTdR购自Amersham公司，抗小鼠CD4(Gk1.5), CD8（2.43）, B220（RA3.3A1/6.1）, Iab(B212)单克隆抗体杂交瘤细胞株均购自ATCC，不同荧光素标记的大鼠抗小鼠单抗CD11cPE, CD40FITC, CD86PE, IabFITC及FITC或 PE标记的同型对照抗体均购自PharMingen公司，4℃保存. C57BL/6（H2Kb）小鼠60只，Balb/c（H2Kd）小鼠24只，6～8 /A280 nm为1.823，测定DNA浓度后经薄板层析证实所制备的B DNA中无LPS存在. B DNA与HpaⅡ酶作用后电泳结果显示，细菌DNA可被顺利切割成小片段，表明所制备的B DNA具有一定的非甲基化CpG基序，冷冻干燥后备用. 1.2.2小鼠BMDC的培养扩增［5］颈椎脱位法处死C57BL/c小鼠，无菌取股骨，冲洗出骨髓细胞，加TrisNH4Cl裂解液室温作用3 min，溶除红细胞，Hanks液洗2次，加入大鼠抗CD4, CD8, Iab, B220单抗混合液，抗体终浓度均为10 mg/L, 4℃孵育45 min, Hanks液洗1次，加入含20 g/L BSA的RPMI 1640培养基及Hepes 25 mmol/L沉悬细胞，再加入兔低毒性补体（10∶1稀释），37℃水浴45 min溶除T, B及Ia+细胞，Hanks洗2次，以1×106细胞/孔加入24孔板培养，加mGMCSF 10 μg/L, mIL4 1 μg/L，培养3 d后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入含有mGMCSF, mIL4的新鲜RPMI1640完全培养基，继续培养2 d 后，吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，收集后BMDC以1×106细胞/孔加入24孔板培养，分别加入B DNA (10 mg/L), LPS(1 mg/L), CT DNA (10 mg/L), PBS置37℃, 50 mL/L CO2培养24 h后，收集BMDC和培养上清待测. 1.2.3流式细胞仪检测BMDC表面标志和内吞能力收集培养各处理组BMDC，用PBS悬浮为1×109细胞/L，加入离心管，100 μL/管，分别加入荧光标记抗体Ia, CD40, CD86, CD11c，终浓度为5 mg/L，置4℃标记45 min，PBS洗2遍，以荧光标记的同型Ig作为对照；用流式细胞仪（FACS calibur，BD公司）CellQuest软件检测和分析BMDC表面标志. 收集