啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建论文.docVIP

　　啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建论文 冯丽玲，卢文婕，曾庆平 【摘要】 【目的】 克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体，为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因，反向插入酵母表达载体pGAPZαA，双酶切鉴定重组子。【结果】 通过PCR扩增获得1 335 bp片段，克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合，相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA.freelid Miniprep System)、DNA片段回收试剂盒(Concert Rapid Gel Extraction System)均 购 自Omega 公司; 聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒 ( One Shot LA PCR Mix)均购自Takara公司; GL20GⅡ型 高速冷冻离心机(上海); 5332 Mastercycler personal型PCR 仪(德国);BGsubMINI 迷你型水平电泳仪(北京);MiniSpin 5452 个人型高速离心机(德国);260010 MicrocoolerⅡ型制冷仪(美国)。 14DNA的提取取5×107酵母细胞加入600 μL山梨醇缓冲液和50 U Lyticase，充分混匀，30 ℃处理30 min，4 000 r/min离心10 min;弃上清液，收集沉淀，加入200 μL裂解液重悬沉淀;加入20 μL蛋白酶K，振荡混匀;加入220 μL缓冲液并充分混匀后，置于70℃水浴15 min;等溶液变清亮，12 000 r/min离心数秒;加入220 μL的无水乙醇，剧烈振荡混匀数秒，此时会出现絮状沉淀;将离心柱装在收集管上，然后将所得溶液及沉淀都转移入离心柱中;12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的滤液;加入500 μL蛋白清洗液，12 000 r/min离心1 min;倒掉收集管中的滤液;并将离心柱放回收集管中;加入500 μL洗涤液，12 000 r/min离心30 s;倒掉收集管中的滤液，并将离心柱放回收集管中; 重复前一步骤操作1次;12 000 r/min离心1 min，去掉离心柱中的所有液体;将离心柱放在一个干净的、新的15 mL离心管中，置于37 ℃烘箱放置5~10 min，待管中的乙醇全部挥发为止; 往离心柱中央悬空滴加经70 ℃水浴预热的100~200 μL洗脱液;室温放置2 min后，12 000 r/min离心30 s，洗脱DNA到离心管中;为了得到更多的DNA，再加100~200 μL洗脱液，室温放置2 min后，再次洗脱DNA。 15引物设计按GenBank M639791设计引物SSYPri5：5’GGTACCATGGGAAAGCTATTAC3’; SSYPri3：5’GAGCTCTCACGCTCTGTGTGTAAAGTG3’; YSSL：5’ CCGCGGCCGCAGTGCGAGACACATTTCAC3’; YSSR：5’GGTCTAGATACCCTTTCGATAATGTTAAC3’，委托Takara公司合成。 16PCR 扩增以提取的酵母DNA为模板，SSYPri 5、SSYPri 3为上下引物，用Takara公司的PCR扩增试剂盒( One Shot LA PCR Mix)扩增，扩增条件为： 94 ℃、1 min→94 ℃、30 s，53 ℃、1 min，72 ℃、3 min，30循环→72 ℃、10 min→4 ℃。 17基因克隆将PCR产物与pMD18T载体连接，转化JM109感受态细胞，涂板，蓝白斑筛选重组子。 18重组质粒鉴定及测序用质粒DNA纯化试剂盒提取质粒，分别经PCR扩增和HimIII、KpnI酶切进行鉴定 。PCR扩增采用Takara公司的Tf1酶，反应条件为：94 ℃、1 min→94 ℃、30 s，57℃、1 min，72 ℃、5 min，30循环→72 ℃、10 min→4 ℃。最后在 ABI Prism 310 DNA测序仪上用RVM引物测序。 19表达载体的构建因GenBank上已登陆的酵母鲨烯合酶DNA序列显示无内含子存在，即酵母鲨烯合酶DNA序列与cDNA序列相同。因此本研究设计以pTYSS重组质粒为模板，利用自定义YSSL 和YSSR扩增引物进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃、1 min→94 ℃、30 s，57 ℃、1 min，72 ℃、5 min，30循环→72 ℃、10 min→4 ℃。将NotI和XbaI酶切PCR产物后所得片段插入相同酶切的p