斑马鱼胚胎取样.docxVIP

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2017-08-20 发布于湖北
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斑马鱼胚胎取样.docx

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斑马鱼胚胎取样

JNKs在斑马鱼胚胎发育过程中的分化表达及功能研究_邹立军在室温25e下,斑马鱼发育进程: 两细胞时期................................................,,1一1.5小时多细胞时期................................................,,2.5一3小时囊胚期......................................................,,6.5一7小时原肠胚时期................................................,,8一9小时神经胚时期.............................,,,.....,,,,,11一11.5小时视原基时期(眼原基开始出现).....................,,16.5一17.5小时脑泡分化时期(脑部开始形成).....................,,23一23.5小时肌肉效应时期(胚胎开始有肌肉运动)............,,28一28.5小时心跳时期...................................................,,32一33小时眼色素时期................................................,,36一36.5小时体色素时期................................................,,40一42小时出膜时期(成体).......................................,,48一50小时原位杂交：取不同时期受精卵十枚，置于4%多聚甲醛（含DEPC）固定后去卵膜。（4度过夜或者室温三小时） Wash with 50% MeOH/PBST (PBST= PBS + 0.5-0.8% TX-100) Wash 2x with 100% MeOH Store at -20°C in MEOH at least overnight (up to 6 months) DAY1 Ⅲ. Rehydration of embryos 8. Wash for 5min each in MEOH: PBST... 3:1, 1:1, 1:3 9. Wash 4X, 5min each in 100% PBST 10. Incubate in proteinase K(dilute 1mg/l stock 100 fold, 10ug/ml PBST) Younger than “bud” 30min Early somitogenesis 1minute Late somitogenesis 2minutes 24hpf 6minutes 36/48hpf 12minutes 11. Wash once(quick) in PBST to get rid of the proteinase K(optional) 12. Refix for 20min in 4% p-formaldehyde at RT 13. Rinse 5X 5min in PBST Ⅳ. Hybridization 14. Prehybridize embryos in hybe+ buffer at 70℃ for 30min-3hours 15. Replace prehybe with hybe+ buffer containing the probes of choice (300ng probes/ 200ul hybe+buffer) 16. Incubate at 70℃ DAY2 17. Remove hybe/probes mixture and store at 20℃ 18. Washs: WashⅠ：50% formamide; 2xSSC; 0.1% Tween20 15min,2X WashⅡ：2xSSC; 0.1% Tween20 15min,1X WashⅢ：0.2xSSC; 0.1% Tween20 30min,2X 19. Replace wash buffer with MABT for 3times, 5min each, at RT. 20. Block embryos in MABT:bloc