生物素标记与化学发光检测技术在核酸杂交与EMSA中的应用.ppt

1.生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用2.Western Blotting的问题与对策;Part of ThermoFisher Scientific;Technical Focus: 有机合成，化学耦联，表面化学和分析化学 Product Focus： 分子生物学：各种化学发光Blotting, EMSA,RPA 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色 试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备, 纯化，片断化, 分型和修饰 交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂… ;1. 生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用;关于生物素;关于生物素/亲和素复合物;生物素/亲和素应用 ;1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应用;标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性生物素标记的DNA探针 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和素结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测 ; North2South 杂交原理和操作流程;Kit组成;探针得率高;检测安全;高灵敏度与高信噪比;方便快速;操作流程与时间;1. 探针制备一之探针标记;2. 探针制备二之探针纯化;探针制备三之探针定量;2. 杂交和洗膜之杂交;2. 杂交和洗膜之严谨洗膜;3. 化学发光检测 ;对照DNA点杂交 ;- ;片段化以确保转膜（去嘌呤）：. DNA 10kb ， 0.2-0.25 N HCl孵育20分钟. RNA 5kb 0.05 N NaOH 30分钟 变性：0.4 N NaOH漂洗30分钟 中和： 1 M Tris, pH 8, 0.6 M NaCl EB去除：0.1％SDS清洗 转膜： 防止核酸扩散 固定：微波炉固定（TE湿润，700－900W 2分钟） 紫外交联（120mJ/cm2,254nm1分钟； 302nm 2分钟（如果没有紫外交联仪，则可以将膜置于80度温箱烘烤2－3小时，可达到固定目的） ;Note 3:模板与探针;Note 4:探针剥离 ;问题与对策一;问题与对策二;问题与对策三;问题与对策四;Note 5:中文说明书;2.2 LightshiftTM化学发光 EMSA;用 途;将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。 DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。 同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。;LightshiftTM化学发光EMSA原理;LightshiftTM化学发光EMSA 特点 ;操作流程;操作时间;Lightshift EMSA Kit与传统的地高辛，P32标记在灵敏性，曝光时间和信噪比的结果比较;极高的信噪比和极短的曝光时间;完整Kit: 100个反应800cm2的膜;抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解） 结合蛋白的浓度 探针的浓度 非特异性探针的浓度 缓冲液的配方和pH 聚丙烯凝胶电泳条件 保温时间和温度 是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素） 反应总体积应最小（20ul） ;待检测蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核蛋白抽提液。 纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白：DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。 用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白以形成特异的复合物。用pierce78833，需要2－3ul。 加入反应的探针的量是50fmole 竞争实验中所用竞争DNA用量为4Pmole（200倍） 反应体积为20ul。 探针应保存在-20oC以防止降解，可长期保存; 由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC))，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。 当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。;非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。浓度一般为6%，在特定条件下可调整聚丙烯酰胺的浓度。 还可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物 大多数蛋白用100-150伏左右的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压。 电泳时所用的TBE和