限制性核酸内切酶切割原理方法结果及应用.pptxVIP

PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓;课堂内容回顾：;Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNA。Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别和切割DNA双链，所 以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测。;限制性核酸内切酶切割原理; ;通过 使 用 (15 种 )限 制 性 内 切 酶 酶 切 重 组质粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法o ;方法：;6.重组质粒的限制性核酸内切酶酶切 取0.5ml离心管15只，分别加入质粒 2μl(2μg)，依 次 加 入 限 制性内 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、SstI、Xba I、Hind皿、EcoR I各0.5微升及相 应的 NEBuffer2μL、BSAμL、去离子水 13.5μL、 混匀、点动离心，37 ℃ 水浴孵育2小时。 7、配置1.5％的琼脂糖凝胶 称取琼脂糖0.6g, 加入 1XTAE 缓 冲 液 40 ml置 微 波 炉 中,中 火120s，熔化后冷却至60℃，加入3μL10g/l溴化乙锭，混匀，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入电泳槽中。电泳槽中加入1×TAE缓冲液。 8、电泳 取酶切产物8μl与DNA上样缓冲液2μl混匀，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可观察到橘红色DNA条带，结果如图 ;Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.;结果 重组质粒pBKrsv-MLCK 全长7378bp，通过 DNAstar软件分析获得各酶酶切位点的信息，选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点，计算酶切后片段大小的理论值经各种限制性内切酶酶切后，获得不同大小的片段，经电泳分析与理论设计完全一致。;结果分析 限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向(orientation)l在选择限制性内切酶时,应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点,这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要。 在进行限制性内切酶实验时首先应进行 DNA的定量，1U 酶的限制性内切酶活性指在一定时间内(60min)~适当温度下和建议使用的缓冲液中,在50μl反应体系中,将1μg底物 DNA 完全消化所需要的酶量l单位活性依所用底物的不同而不同,使用其他底物时,应根据情况确定所用酶量l根据本实验室的经验,1μg底物 DNA 加入 5 U 的限制性内切酶在2h时间内可以酶切完全，通常延长消化。 ;实验中可能出现的问题及其讨论; 解决方法 1.标准底物检测酶活性 2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 3.检查反应系统是否最佳 4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株 5.换用不同切割非甲基化位点的同类酶消化DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增 6.将DNA底物与λDNA混匀进行切割验证 7.换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证;解决方法;1.用λDNA作底物检查酶切结果 2.电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段;限制性核酸内切酶的应用;用于DNA基因组物理图谱的组建; 将水稻叶绿体的DNA，用EcoR1限制性核酸内切酶消化后，放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝胶中做电泳分离。从LMP中分离出分子大小为1.8-2.5kb之间的DNA片段，再与同样经过EcoR1限制性核制性内切酶切割并用碱性磷酸酶做了脱磷酸化处理的pBR322质粒连接，然后将混合物转移到大肠杆菌5346菌株，培养在氨苄青霉素选择板上，形成Ampr转化子菌落群体???这样就构成了由EcoR 限制性核酸内切酶切割的水稻DNA基因组库。用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的psbA DNA探针做菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体。从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒DNA，经进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因psbA的序列。;应用二;