多克隆抗体技术-上海闪晶-荧光定量PCR-多肽合成-全基.PDF

多克隆抗体技术 （Polyclone antibodies preparation technique ） 一、概述 （一）多克隆抗体的概念 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的 一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受 该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相 应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生 的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产 生 IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD 等五类抗体。 （二）免疫动物 供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。 动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用 大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体， 则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制 备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则 非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进 行免疫。 抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类 抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好是 选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的 cDNA 文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降 解的蛋白质抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的 分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。 抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。剂 量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内， 抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言，小 鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为 100μg～1 000μg ／次，兔为 200μg～1 000μg/ 1 热线电话：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@ 网址： 次。加强计量为首次剂量的 1／5～2／5。 免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和 跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而 言，采用弗氏完全佐剂，则需注射 0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大 10 倍以上。如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。如需要获得高效价的 抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。 两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的 敏感作用。一般间隔时间应为 5~7 天，加佐剂者应为 2 周左右。 注射的 Ig 纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时， 极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。 （三）佐剂的应用 对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用 加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。 1．佐剂的类型 目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡 油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。 ⑴ 弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant,IFA） 羊毛脂 1 份 石蜡油 5 份 混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至 50℃左右，加抗原进行乳化处