无菌、生物检查法方法学验证实例.pptVIP

无菌检查、微生物限度检查 方法学验证实例;虎杖苷注射液无菌检查的方法验证 ; 方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜 过滤法方法验证 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。 ;菌液制备： 取经34℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7约为50～100cfu/ml备用。 取经24℃培养18～24小时的白色念珠菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5约为50～100cfu/ml备用。; 取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。 取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～100cfu/ml备用。 ; 供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋 白胨溶液30 ml溶解后，过滤。 7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。 ;; 方法验证 直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。 ;薄膜过滤法： 取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗 500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37℃-培养3～5d，逐日观察，结果见表2、3、4。 ;;;;结论： 根据上述结果，由于采用直接接种 法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。 ;头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证;验证试验用菌种： （1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]； (2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]； (3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102]； (4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]； （5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]； (6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]； (7) 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。 ; 仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批北京牛牛基因有限公司。 方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验 ; 操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时； ; 取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。 取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。 ; 白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3], 25.5±2.5℃培养24～48小时。 取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理盐水9ml，混匀备用。 ; 将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃培养5～7d，使大量的孢子成熟。取经25℃培养