磷脂酰肌醇3―激酶在间歇性低氧对抗大鼠心肌缺血-再灌注损伤中保护机制.doc

磷脂酰肌醇3―激酶在间歇性低氧对抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤中保护机制 　　[摘要]目的 研究磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在间歇性低氧（IH）对抗大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）损伤中的作用机制。方法 将60只大鼠随机分为四组，分别为假手术组（n=15）、I/R组（n=15）、IH+I/R组（n=15）、IH+I/R+PI3K抑制剂组（n=15）。将大鼠暴露在低氧循环制作IH动物模型，通过球囊结扎冠脉方法制作心肌I/R动物模型，通过TTC染色确定梗死面积。采用Western blot法检测蛋白激酶B（AKt）表达。结果 与I/R组比较，IH+I/R组的心肌梗死面积下降（P 　　1材料与方法 1.1实验动物及试剂材料 取8～10周雄性SD大鼠60只，体重（200±20）g，由南昌大学动物实验中心提供。渥曼青霉素购自Alexis公司，小鼠抗Akt单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；蛋白浓度测定标准品购自普利莱公司；兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Sigma公司 1.2动物模型建立 本实验研究经南昌大学医学院动物伦理委员会审查通过，许可证号为SCXK（赣）2009-0001。将实验动物随机分为4组，制作老鼠IH模型：暴露在每日4次的低氧循环（每次接受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再氧和处理，5次），IH处理14 d，含氧量正常的降支老鼠作为对照组。假手术组（n=15）：丝线穿过冠状动脉但左室支但不结扎，通过尾静脉注射生理盐水；I/R组（n=15）：参考垫扎球囊法[5]制作大鼠I/R模型；IH+I/R组（n=15）：建立IH动物模型后，制作I/R模型；IH+I/R+PI3K抑制剂组（n=15）：建立IH模型，制作I/R模型时，在冠状动脉左前降支闭塞15 min前注射PI3K抑制剂-渥曼青霉素（24 μg/kg） 1.3心肌梗死面积测定 制模结束后处死存活大鼠，取新鲜大鼠心脏，用PBS冲洗，-20℃冰冻30 min切片，再用1% TTC 37℃染色25 min，切片放甲醛过夜增强颜色对比。梗死区不染色，非心肌梗死区染色为红色。扫描仪扫描心脏切片，使用Image proplus 6.0软件测量相关区域面积，梗死面积（%）=左心室组织切片梗死区面积/左心室组织切片总面积×100% 1.4 Western blot法检测Akt蛋白表达 制模结束后处死手术处理后的存活大鼠，通过组织颜色改变判断心肌正常组织和缺血组织，通过Western blot方法来测定Akt蛋白，提取各组心肌组织，按蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，监测蛋白浓度，收集上清液，采用考马斯亮蓝法进行担保定量。SDS分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，常温下TBST封闭过夜，再加入anti-Akt 小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，加入兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗2 h。洗膜，显色。具体方法参照文献[9]，实验胶片扫描后用Image J软件进行图像分析，比值结果表示蛋白的相对含量，用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值 1.5统计学分析 采用SPSS 15.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间两两比较应用q检验，多组间比较应用单因素方差分析，以P 　　[3]Nishimura N，Siegmund A，Liu L，et al.Phospshoinositide 3-kinase（PI3K）/mammalian target of rapamycin（mTOR）dual inhibitors：discovery and structure-activity relationships of a series of quinoline and quinoxaline derivatives[J].J Med Chem，2011，54（13）：4735-4751. [4]Bursavich MG，Brooijmans N，Feldberg L，et al.Novelbenzofuran-3-one indole inhibitors of PI3 kinase-a and the mammalian target of rapamycin：hit to lead studies[J].Bioorg Med Chem Lett，2010，20（8）：2586-2590. [5]?w秀梅，孙胜，刘秀华.垫扎球囊法复制大鼠在体心肌缺血/再灌注模型[J].中国微循环，2006，11（3）：206 -208. [6]Serebrovskaya TV，Nosar VI，Bratus LV，et al.Tissue oxygenation a