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肉制品中沙门氏菌荧光定量PCR标准质粒构建 　　摘要：目的 制备用于检测肉制品中沙门氏菌荧光定量PCR的标准质粒。方法 设计针对沙门氏菌invA基因的引物，扩增特异片段，转入质粒载体中构建重组质粒。将构建的重组质粒作为标准品，进行优化后的实时荧光定量PCR，建立标准曲线，并考察该标准品灵敏性及稳定性。结果 成功构建含有沙门氏菌invA基因的质粒标准品，用其建立的标准曲线循环阈值（Ct值）与模板的拷贝数呈良好线性关系（r2=0.9979），最低可以检出10 拷贝/反应。该标准质粒经验证具有良好的稳定性。用该质粒标准品检测肉制品中的沙门氏菌，经2h增菌后，可在7h内完成对样本的检测。结论 所构建的质粒标准品可用于荧光定量PCR检测肉制品中的沙门氏菌，为考量实验质量提供参考依据 关键词：质粒标准品；荧光定量PCR；沙门氏菌；肉制品； 当前，微生物污染引起的食源性疾病已引发人们的普遍关注和深入研究。在各类食源性病原菌及危害因子中，沙门氏菌是主要致病因子[1]。根据我国统计数据显示，由沙门氏菌导致的食源性疾病占总数的10.2%，且以肉制品受污染居多[2，3]。建立有效手段快速检测肉制品中沙门氏菌，对防控和监测这类食源性疾病意义重大 荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction， qPCR）方法可快速并灵敏地对沙门氏菌进行检测，而拥有可靠的标准品保证了检测的稳定和可重复性[4]。目前，获得荧光定量PCR标准品的方法有许多，包括菌液提取模板DNA、PCR扩增产物纯化、PCR扩增目的片段割胶纯化以及构建含与目的基因片段相同序列的重组质粒等，其中以质粒作为标准品最为稳定，且制备简单，使用方便。本研究选择质粒作为荧光定量PCR的标准品，设计选取了沙门氏菌invA基因特异性片段，将其转入质粒载体中构建重组质粒，以此保证快速、准确检测肉制品中沙门氏菌，为快速检测该致病菌导致的食源性疾病提供技术依据 1.材料和方法 1.1材料和试剂 1.1.1试验菌株 本实验采用菌株：鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）、阪崎肠杆菌（ATCC 51329）、大肠埃希菌（ATCC 25922）、副溶血弧菌（ATCC 17802）、?~绿假单胞菌（ATCC 27853）、宋内志贺菌（ATCC 11060）、创伤弧菌（总18-85）、小肠结肠耶尔森菌（Y1）。ATCC菌株购自美国标准生物品收藏中心，其余菌株为本实验室收集、鉴定、编号并保存的菌株 1.1.2主要试剂和仪器 LB培养液（上海市疾病预防控制中心试剂供应研究中心）；mericon DNA Bacteria Kit（Qiagen公司）；pMD？ 18-T Vector Cloning Kit、大肠埃希菌DH5α感受肽细胞（日本TaKaRa公司）；TaqMan？ Environmental Master Mix 2.0，ABI 7900HT荧光定量PCR仪（美国lifetechnologies公司）；NanoDrop2000核酸蛋白仪（赛默飞世尔科技（上海）有限公司） 1.2方法 1.2.1引物设计和探针制备 根据GenBank公布的沙门氏菌invA基因（GenBank： M90846.1）的高保守序列[5]，利用引物设计软件Oligo 7设计引物、探针，并用BLAST检查序列的特异性。引物序列为：invA-F：5-TCTACATTGACAGAAT-3’，invA-R：5- CGAACGTGGCGATAATTTC-3’；探针序列：invA-P：5’-FAM-CAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAAT-TAMRA-3’，克隆质粒扩增引物：invA-S：5-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’，invA-AS：5-AGTGCTCGTTTACGACCTG-3’。由生物工程（上海）有限公司合成 1.2.2细菌DNA提取： 按照细菌DNA提取试剂盒的说明书提取模板DNA。DNA模板保存于-20 ℃备用 1.2.3荧光定量PCR反应体系的建立及优化： 对加入模板DNA、引物、探针的量进行优化，并选择最佳退火温度。在20 μL反应体系中， TaqMan？ Environmental Master mix10 μL，引物invA-F和invA-R终浓度为0.75 μM，探针invA-P终浓度为0.2 μM ，模板DNA2 μL，ddH2O补足至反应总体积。反应条件：95℃变性5s，60℃退火30s，共进行40个循环。每个样本设3个平行。用SDS2.4软件（Life technologies）分析结果 1.2.4 重组质粒标准品的制备： 用invA-S和invA-