冰片对大鼠血小板胞浆内游离钙离子浓度的影响论文.docVIP

　　冰片对大鼠血小板胞浆内游离钙离子浓度的影响论文 【摘要】 目的研究冰片对血小板内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)的影响，以探讨其抗血小板聚集作用的可能机制。方法采用双波长Fura-2 荧光法测定血小板胞浆内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)。结果在有无细胞外钙存在时，冰片血清均能够明显抑制5-HT诱导的血小板胞内［Ca2+］i升高（P 0.05）。结论冰片可抑制血小板聚集，其作用机制可能与其抑制血小板胞浆［Ca2+］i升高有关。 【关键词】 冰片； 血小板聚集； 钙； 5-羟色胺 ChinaAbstract：ObjectiveTo investigate the effect of bornel on cytoplasmic free calcium level in rat platelets and its possible mechanism of anti-platelet aggregation.MethodsPlatelet［Ca2+］i ined by double beam fluorescence spectrophotometric method.ResultsSO）、羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）均为Amersco公司产品；牛血清白蛋白（BSA），由华美生物工程公司提供；Amresco公司产品；5-羟色胺硫酸肌酐，sigma公司产品，用0.1 mol/L HCl溶液溶解后，用Tris-NaCl溶液调pH为7.4，分装，-70℃避光冻存；乙二醇双（2-氨基乙基）醚四乙酸（EGTA），MBCHEM公司产品，用新鲜配制的1 mol/L NaOH配制成0.5mol/L的溶液（pH8.5）；TritonX-100，Amresco公司产品，用三蒸水配成20％的溶液；ACD溶液含柠檬酸钠89 mmol/L、柠檬酸16 mmol/L、葡萄糖243 mmol/L；无Ca2+的Hepes缓冲液含NaCl 140 mmol/L、KCl 3 mmol/L、MgSO4 1 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，用1mol/L NaOH调pH7.40； 血小板负载液含NaCl 140 mmol/L、KCl 3 mmol/L、MgSO4 1 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，0.4%BSA，用1mol/L NaOH调pH7.40，使用前预先通氧饱和；其它均为国产分析纯，所有试剂均用新鲜制备的三蒸水配制。 1.3 仪器LS-55 荧光分光光度计，美国Perkin-Elmer公司产品。 2 方法 2.1 冰片含药血清的制备取雄性SD 大鼠20 只，随机分为冰片组和溶剂对照组，每组10 只。冰片组灌服冰片粟米油溶液（1.5 g·kg-1）15 ml·kg-1，给药1 次，药后30 min，腹主动脉取血，400 r/min离心15 min，分离血清，56 ℃水浴30 min 灭活，得冰片血清，置-70℃冰箱保存备用。溶剂对照组给等容量的粟米油，按上述方法制备空白血清。应用气相色谱法测得冰片血清中含冰片12.16 μg·mL-1。 2.2 水洗大鼠血小板悬液制备大鼠以10％水合氯醛35mg/kg体质量腹腔注射麻醉，腹主动脉穿刺取血8 ml，用ACD溶液以1∶5（ACD∶血）的比例抗凝，在(20±2)℃下76×g离心15 min，吸取上层富含血小板血浆（PRP），再将PRP在(20±2)℃下以500×g离心5 min，弃上清，得血小板沉淀，用无Ca2+的Hepes缓冲液洗1次，450×g离心5 min，弃上清，用无Ca2+的Hepes缓冲液悬浮。台朌蓝排斥试验检查细胞活性，活细胞率 90%。 2.3 Fura-2/AM负载取1 ml血小板悬液与1ml血小板负载液，5 μmol/L Fura-2/AM混匀，使得Fura-2/AM在血小板悬液中的终浓度为2.5 μmol/L，37℃水浴避光孵育40 min，立即离心，弃上清，沉淀以无Ca2+ Hepes缓冲液洗两次，再用无Ca2+ Hepes缓冲液重新悬浮，调整血小板浓度为300～400×109个plt/L待测。 2.4 分组及给药负载后的血小板悬液分为3组，分别是空白血清组、冰片血清低浓度组、冰片血清高浓度组。各组均于测定前用相应的空白血清或冰片含药血清37℃孵育10 min后，进行荧光测定。 2.5 荧光强度测定［1，2］取负载的血小板悬液37℃温孵5 min，在PE LS-55型荧光分光光度计上做荧光测定，固定发射波长为510 nm，扫激发波长，如激发波长波峰由380 nm移至340 nm，则表明Fura-2/AM已负载酯解进入细胞内。采用FFA模块的改变波长的时间扫描，激发波长分别固定在340 nm、3