宫颈癌组织HPV16 URR及E7基因突变和序列多态性分析论文.docVIP

　　宫颈癌组织HPV16 URR及E7基因突变和序列多态性分析论文 赵雪珍 王言奎 彭丽娜 张红 【摘要】 目的 分析山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)上游调控区(URR)和E7开放读码框(OFR)基因突变和基因序列多态性。方法 收集山东省青岛地区妇女宫颈癌标本共111例，提取DNA作为模板，应用通用引物和型特异引物经聚合酶链反应(PCR)筛选HPV16阳性标本，PCR结合测序检测HPV16阳性标本URR和E7基因全序列，经DNAStar 100软件和在线BLAST分析其变异情况。结果 宫颈癌组织中HPV和HPV16感染率分别为99.10%(110/111)和73.63%(81/110);核苷酸水平上HPV16 URR形成24种变异模式，同源性在98.02%～99.26%之间，nt7518 G→A和nt7861 A缺失变异率均为100%(26/26)。HPV16 E7形成12种变异模式，同源性在99.23%～100%之间;nt647 A→G突变率58.54%(24/41).freelutation and polymorphism of HPV16 URR and E7 gene in cervical cancer samples in Qingdao of Shandong province. Methods A total of 111 cancer samples plate. The detection of HPV and the typing of HPV16 carried out using consensus and typespecific primers. The amplifications of HPV16 URR and E7 gene plete sequences ed by PCR ation ents formed 24 patterns at nucleotide level, their homology ents formed 12 patterns mutation at amino acid level, their homology ino acid Ser substituted for Asn. nt666 G→A ino acid. Conclusion There are variations in both HPV16 URR and E7 genes at nucleotide level in Qingdao. The mutational hot spots of HPV16 URR are nt7518 and nt7861 and HPV16 E7 is nt647, both of them still have mutational spots that have not yet been reported. KEY ixture、6×Loading Buffer、DNA分子标志物DL 2000、DNA提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。 1.2 方法 1.2.1 引物的设计、合成 βGlobin、HPV L1及HPV16 E6、URR、E7引物序列见文献23。各引物序列均由上海生物工程技术服务有限公司合成。 1.2.2 组织DNA提取、PCR反应体系和条件 新鲜组织用酚氯仿异戊醇法常规提取DNA,石蜡切片组织按QIAmpDNA提取试剂盒说明书步骤提取DNA作为模板。PCR反应总体积均为25 μL，其中模板DNA约50 ng，dNTP 200 μmol/L，上、下游引物各为0.5 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，MgCl21.5 mmol/L，10×PCR扩增缓冲液2.5 μL，加无酶水至25 μL。 1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 将PCR产物置于16 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳。长度为268、450、140、617和315 bp扩增条带分别为βGlobin、HPV L1及HPV16 E6、URR、E7目的基因条带。 1.2.4 PCR产物测序及序列分析 将PCR产物送北京华大基因研究中心纯化后进行双向测序，凡发现突变的样品均经PCR重新扩增,并再次测序以排除PCR过程中碱基错配而可能产生的误差。最后，应用DNAStar 100软件和在线BLAST查找HPV16 URR和E7基因片段变异位点并进行序列多态性分析。 2 结 果 2.1 PCR扩增 2.1.1 βGlobin扩增结果 所有111例标本均在268 bp处出现目的条带。重复检测结果相同，故上述111份标本均纳入本次实验。 2.1.2 HPVL1和HPV16 E6扩增结果 110例PCR产物在450 b