实验SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量.ppt.PPT

实验 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量 实验原理 电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区间，故称区带电泳。 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂（如过硫酸铵）和增速剂（如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，TEMED）的情况下聚合而成的。丙稀酰胺的聚合通常是由化学催化或光化学过程完成的,常用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素来引发这个过程，用TEMED、3-二甲胺丙腈等作为聚合过程中的增速剂。 实验原理 实验原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳，它由浓缩胶和分离胶两部分所组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理： 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 实验原理 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合. 蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。 带负电荷的蛋白质-SDS复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。 实验原理 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系，符合下列方程式： lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 实验步骤 凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl 实验步骤 电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源。对于垂直板型电泳，一般样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20分钟；样品进胶后，将电流调到40～50mA,保持电流强度不变。待指示染料迁移至下沿约1～1.5cm处停止电泳。 剥胶和固定：电泳结束后，取下凝胶膜，卸下凝胶膜上的橡胶框，用镊子将短板玻璃撬开后取出凝胶板。在溴酚蓝区带的中心作好标志（插入细金属丝），用水慢慢冲洗一下胶面。将胶置于培养皿内，放入固定液（或10%W/V三氯乙酸），没过凝胶板。固定2小时以上或过夜。 实验步骤 染色：弃去固定液，加入染色液。染色4小时以上或过夜。有两种染色液可供选择。 脱色：染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。一天换2～3次脱色液，直至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质色带清晰为止。脱色时间一般约需一昼夜（注意：与上述两种染色液相对应，也有两种脱色液）。 蛋白质分子量的求算：以样品蛋白质迁移率比照标准蛋白质的迁移率计算样品的分子量。 * * 丙烯酰胺 N,N’-甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶三维结构