《生物钟基因Per2及其相关因子在非小细胞肺癌中的表达 .docVIP

《SMAD3基因抑制TGF-β诱导的非小细胞肺癌上皮-间质转化作用机制研究》可行性研究报告 一、立项的背景和意义 肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡率的主要原因之一1 2。肺癌根据组织病理可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC)，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的85%，并且其发生率每年都在增加。尽管对于肺癌患者的诊断及治疗水平不断提高，但是总的5年生存率依旧维持在15%左右3。由于肺癌早期无特异的临床症状，多数病例特别是周围型肺癌在早期可以不呈现任何症状，并且大多数患者明确诊断时已属于晚期，也就是发生了转移。因此对NSCLC侵袭、转移机制的研究已成为当前国内外研究的热点。 MiR-203是近年来发现一种新的microRNA, 已有的研究发现其在多种肿瘤发生发展过程中起到抑癌或抑制肿瘤转移的作用。在食管癌25、口腔鳞癌26、恶性胸膜间皮瘤27、肝癌28、膀胱癌29、骨髓瘤30等肿瘤疾病的研究中发现，相对于非癌组织，癌组织中miR-203的表达显著下调。MiR-203通过抑制细胞增殖扮演着肿瘤抑制作用，如在前列腺癌中，已证实miR-203的表达缺失和由此而引起的LASP1过表达可能导致了前列腺癌的进展31。在喉鳞状细胞癌中，miR-203很可能通过调节ASAP1起到抑制肿瘤细胞增殖的作用，同时能诱导凋亡32。但miR-203在NSCLC中的作用，尤其是对肿瘤细胞中TGF-β信号通路的影响尚无报道既往已有研究表明，SMAD3在多种肿瘤的发展过程尤其是转移阶段起着“促癌基因”的作用：如microRNA-140可通过靶向SMAD3抑制结直肠癌癌细胞的迁移和转移16；在前列腺癌的发生发展过程中，SMAD3通过调节MMP9的表达在肿瘤转移过程中发挥了重要作用17。在胰腺导管腺癌中，上调的SMAD3可促进肿瘤细胞的EMT过程，同时还抑制了肿瘤细胞的凋亡18。但究竟是何种机制导致了SMAD3在肿瘤转移过程中表达上调尚不明确。为进一步探讨miR-203抑制肿瘤转移的机制，我们TargetScan，PITA，RNAhybrid等软件对TGF-β经典通路中可能存在的miR-203的靶基因进行了预测，综合软件分析结果显示SMAD3的3UTR保守序列中存在miR-203结合位点。为对这一结果进行验证，我们将合成的miR-203 mimics转染入A549细胞，48小时后提取细胞总RNA及蛋白分别检测SMAD3的表达，发现SMAD3表达量在RNA及蛋白水平均发生了明显下降。（图1） 图1. MiR-203 mimics转染A549细胞(A)后,分别用实时定量PCR及western blot方法检测SMAD3 mRNA(B)及SMAD3蛋白（C)的表达水平 综合上述文献及实验结果，我们提出假设：SMAD3是miR-203的靶基因，miR-203调控SMAD3可抑制TGF-β诱导的EMT，从而抑制肿瘤转移。(图2) 图2. MiR-203调控SMAD3抑制TGF-β诱导的EMT的机制假设 在此假设前提下，我们进行了相关的前期预实验，结果表明：1）相对于正常肺支气管上皮细胞HBE细胞株，miR-203在多株NSCLC细胞系中均为低表达(P0.01)；SMAD3mRNA的检测结果则与miR-203相反，在上述多株NSCLC细胞系中的表达均高于在HBE的表达(P0.01)。与对照组相比，miR-203 mimics转染细胞中的SMAD3 mRNA及蛋白表达明显下调, 初步表明miR-203能够影响SMAD3的表达。3) miR-203转染A549细胞后检测E-cadherin表达发现其明显上调，Transwell实验结果显示miR-203能显著抑制TGF-β1诱导的A549细胞的迁移能力。 本项目拟以我们提出的假设为工作原理，以预实验为基础，运用慢病毒载体构建、microRNA转染、实时定量RCR、western blot、Wound healing, transwell等技术，阐述miR-203与SMAD3之间的相互作用机制以及miR-203在NSCLC 细胞的上皮-间质转化过程中的作用，同时明确在NSCLC组织样本中miR-203与SMAD3的表达是否相关，进一步阐明miR-203的表达对TGF-β信号通路的影响以及在NSCLC发生发展中的作用，为NSCLC的诊断和治疗提供新的实验依据。 1）MiR-203、SMAD3在NSCLC细胞及组织中的表达检测。 2）验证miR-203可通过直接靶向SMAD3 mRNA来调控后者的表达。 ）研究miR-203对TGF-β诱导的EMT过程以及侵袭转移能力的影响 技术关键