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miRNA引物设计方法概要
Real-time PCR 引物 引物设计原则 1、引物长度一般为15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。 2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C 3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。 引物设计原则 5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。 7、引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 * ACAACC 成熟序列反义连3端后6-8个碱基做完RT引物的粘附序列部分 RT引物的茎环序列 5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC-3’ 茎环序列（前）+粘附序列（后）构成miRNA的RT primer 5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC ACAACC-3’ 成熟序列反义连3‘端后6-8个碱基做为RT引物的粘附序列部分 ACAACC *
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