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Chapter 19 Homologous and Site-Specific Recombination 1. Please explain why most of engineering E. coli cell strain for protein over-expression has the genetic type of RecA- ? (3 points) 答：大肠杆菌中的RecA蛋白是第一个被发现的DNA链转移蛋白，这类蛋白质在重组中起着核心作用。如果某质粒可能携带可作为大肠杆菌重组系统的底物的DNA重复序列，那就应该考虑换用重组缺陷型菌株的可能性。用携带有recA基因突变的菌株就几乎没有重组的可能性。 2. Please read Invitrogen catalog, and explain how a single Gateway entry plasmid can be applied for multiple different applications. Detail description is expected. (7 points) 答：Gateway这种克隆方法可以使DNA片段通过位点特异的重组在载体之间转移。它是利用λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。λ嗜菌体Gateway就是基于这种λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个克隆。LR反应是一个attL克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。完成构建Gateway?表达克隆仅需两步：创建克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进载体。混合包含目的基因的克隆和合适的目的载体及GatewayLR Clonase，产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。） 利用了位点特异重组3. Please read textbook carefully, briefly design a method to distinguish “sequential exchange” or “concerted cutting” during recombination between attP and attB. (5 points) 答：“自杀底物”可以使重组反应停留在中间体的阶段，此时核心序列被切开，而这个切口干扰了重组过程，这样就可以识别出已经起始重组，但还未完成的分子，这些中间体的结构表明单链交换是按前后顺序发生的。 4. Please read textbook carefully and describe differences between type I topoisomerase and type II topoisomerase. 答：DNA拓扑异构酶是可以催化DNA拓扑结构变化的酶。它们暂时解开DNA的一条或两条链，使没有断裂的链穿过缺口，然后重新封住缺口。I型拓扑异构酶在DNA中的一条链上产生一个暂时的缺口，II型拓扑异构酶引入一个暂时的双链断裂。 Chapter 20 DNA Repair System 1. Please list RecA’s function in both DNA recombination and DNA repair (5 points) 答：在DNA重组中： RecA具有的处理DNA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反应称为单链同化。这个置换反应可以发生在几种不同构型的分子之间，并需要三个一般性条件： 其中一个DNA分子必须有单链区域；有一个分子必须有游离的3’端；单链区域和3’端必须位于这两个分子的互补区域中。 单链同化需要一个中间体以使两条单链从一条双链体交叉到另一条，RecA可以催化这个阶段的反应。在细菌中，RecA作用于RecBCD所产生的底物，而RecBCD介导的解链和切割可以产生起始异源双链体连接点形成的末端，RecBCD在chi位点切开释放出3’端，RecA可以携带含此3’端的单链并使它与同源的双链体序列作用，于是就产生了联合分子。 在DNA修复中： RecA蛋白直接参与重组修复，它还有另一个功能：可以被许多导致DNA损伤或抑制大肠杆菌复制过程的处理激活，这些处理使它引发一系列复杂的表型变化，称为SOS应答。起始应答的事件是RecA被损伤处理所激活，RecA的激活引起LexA基因产物的蛋白酶解切割，这种LexA发生自我切割后导致其自身的阻遏操纵子的活性失