同工酶测定.docVIP

保护酶（SOD、POD、CAT、APX）同工酶分析 酶液提取：称取1g样品鲜叶，在冰浴条件下加酶提取液（0.1 mol· Tris-HCl缓冲液pH8.0（每100ml内含半胱氨酸0.073g、抗坏血酸0.105g、EDTANa20.075g、甘油10ml、1mol·HCl 5.84ml）2ml，研磨至匀浆，然后在低温冷冻离心机中4℃、13000r·min离心20min，上清液极为酶提取液。 邹琦，2000OD、CAT为7.5%，SOD、APX10%，浓缩胶浓度为3%（配方如表1）。电泳时采用稳流控制，SOD、POD、CAT浓缩胶为15mA/板，分离胶mA/板APX电泳浓缩胶分离胶为mA/板，mmol·L-1抗坏血酸，上样前预电10min。电泳至溴酸蓝标志到达凝胶前沿为止。·L-1 NBT溶液）中于黑暗下浸20min；（2）在B液（含有28μmol·L-1 核黄素、2.8mmol·L-1 四甲基乙二胺的36mmol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中于黑暗下浸15min；（3）在C液（含10mmol·L-1 EDTA的0.05mol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）表聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板配置方法 Tab Gel and dyeing solution compounds 药剂 分离胶10% 分离胶7.5% 浓缩胶3% 30%Acr 9.75 ml 7.3 ml 1 ml 1%Bis 7.50 ml 5.6 ml 1 ml 分离胶缓冲液 3.75 ml 3.75 ml 浓缩胶缓冲液 2.5 ml 蒸馏水 8.80 ml 13.15 ml 5.43 ml 10%过硫酸铵 0.20 ml 0.2 ml 0.07 ml TEMED 15 μl 15 μl 5 μl POD同工酶电泳染色：采用联苯胺溶液染色法（邹琦，2000）·L-1 HAC 10ml，15mol·L-1 NaAC 10ml，H2O 70ml，最后加入3-5滴H2O2，将此显色液倾入20cm培养皿中，待电泳凝胶片加入后不断搅动，观察各条带显色的先后，照像或画出POD同工酶谱带，最后用7%醋酸固定。 CAT同工酶的染色方法：采用淀粉法（张宪政，1994）染色。将1%可溶性淀粉溶液于沸水浴中充分煮沸至无色透明。胶片脱下后放入上述溶液中4浸泡小时分钟。倾出淀粉液加入过氧化氢溶液，室温静置，然后用双蒸馏水漂洗几次，加入溶液（取1，用双蒸馏水定容至加冰醋酸使之酸化），将漂洗好的胶片放入。室温下背景逐渐变蓝色，酶活处无色透明，清晰后立即以蒸馏水漂洗，并迅速照相，记录，以防谱带消失。 APX的染色方法：采用Rao等（1995）的方法染色。首先，用含有的2mmol·抗坏血酸的50mmol·磷酸钠缓冲液（H7.0）进行平衡30min，然后用含有4mmol·抗坏血酸和2mmol·H2O2的50mmol·磷酸钠缓冲液（H7.0）进行温育20min，在用100mmol·磷酸钠缓冲液（H7.5）冲洗1min，显色液为含有28mmol·TEMED和2.45mmol· NBT的磷酸钠缓冲液（H7.8），温和摇动，10min后即可根据显色情况用蒸馏水冲洗中止反应，对图像进行观察、保存和分析。=