凯氏定氮法测定蛋白质的含量.docVIP

凯氏定氮法测定蛋白质的含量 一、原理：有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。 二、试剂与材料： 浓硫酸、硫酸钾－硫酸铜粉末（称取80g硫酸钾和20g硫酸铜（五水），0.3g二氧化硒研细混合）、30％氢氧化钠溶液、2％硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂（田氏指示剂）储存液（取50ml0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1％甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。此指示剂在PH5.2为紫色；PH为5.4为暗灰色或灰色；PH5.6为绿色；变色点为PH5.4）、硼酸－田氏指示剂混合液（100ml2％硼酸溶液，滴加约1ml田氏指示剂，摇匀后，溶液呈紫红色）、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉 浓硫酸 500ml 硫酸钾 200g 硫酸铜 200g 硼酸 50g 盐酸 200ml 甲基红 0.5g 溴甲酚绿 0.5g 三、操作方法 1、样品处理：固体样品，应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2－1.0mg范围内。 2、消化：取一定量样品，于50ml干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾－硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。用电炉加热，在通风厨中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。 另取凯氏瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。 3、蒸馏：将微量凯氏蒸馏装置洗涤（先用水蒸气洗涤）干净。将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。 吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。 取一三角瓶，加入10ml硼酸－田氏指示剂混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。 加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子，凯氏蒸馏。三角瓶中的硼酸－指示剂混合液，吸收蒸馏出的氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸1－2min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。 4、滴定：样品和空白均蒸馏完毕后，用0.01M标准盐酸滴定，至硼酸－指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。 四、计算 样品总氮量（mg））C：标准盐酸的当量浓度 14：氮的相对分子量 20：用于蒸馏的稀释消化液体积 100：稀释消化液的体积 样品中粗蛋白含量（mg））