影响血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳实验分离效果的因素.docVIP

影响血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳实验分离效果的因素： 【1】电泳介质pH的影响： 对于蛋白质及氨基酸等两性物质，电泳介质的pH影响蛋白质的电泳情况 即可决定蛋白质的带电量（Q）。 pI-pH0，分子带正电荷，向负极泳动； pI-pH0，分子到负电荷，向正极泳动； pI-pH=0，兼性离子，净电荷为零。 pH偏离等电点越远，分子所带净电荷越多，其泳动速度越快。 所以，当┃pI-pH┃接近零时，分子处于等电状态，不移动，影响条带清晰度，从而影响实验分离效果。 【对应注意点】由于血清蛋白质的等电点多在pH 4～6 之间，因此，分离血清蛋白常用pH 8.6的巴比妥缓冲液或者三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。 【2】缓冲溶液的离子强度： 离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰； 离子强度高，电泳速度慢，但区带分离较清晰。 离子强度过低，缓冲溶液的缓冲量小，不易维持pH的恒定； 离子强度过高，则降低蛋白质的带电量使电泳速度减慢。 所以，当离子强度过低时，电泳速度虽快，但易引起分离区带不清晰； 当离子强度过高时，虽分离区带清晰，但点用速度过慢，所以要选择合适的离子强度。 【对应注意点】离子强度的选择要合适，一般常用的离子强速为0.02～0.2之间。 【3】电场强度的影响： 电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度一每厘米的电势差计算，也称 电势梯度。电场强度越高，则带电离子的移动速度越快。随着电场强度的 增高，电流强度增加，产热也增多。 产热的不良后果：①引起水的蒸发，改变溶液pH及离子强度 ②引起介质温度高，可使蛋白质变性。 另外，当电场强度过高时，电泳速度也会很快，分离区带将不清晰。 【对应注意点】电泳实验要控制在一定范围之内，进行高压电泳时，必须装备有效的冷却装置。 【4】电渗： 在电场中，由于多孔支持物吸附水中的离子使支持物表面相对带电，在电 场作用下，溶液就像一定方向移动，此种现象称作电渗。 在外电场的作用下，水向负极移动。 如果被测定样品带正电荷，则移动更快，区带分离不清晰； 如果被测定样品带负电荷，则移动减慢，区带分离较清晰。 所以，颗粒泳动所表现出来的速度决定于颗粒本身的泳动速度和溶液的电渗作用。 【对应注意点】在选用支持物时，应尽量避免高电渗作用的物质。 【5】支持物的选择： 醋酸纤维素膜具有均一得泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用 它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广 和快速便捷，且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液经跑透明，透明后的 薄膜便于保存和定量分析。 所以，本实验以醋酸纤维素薄膜作为支持，于薄膜的一端加微量血清，膜两端连接于缓冲溶液。因此，各种蛋白质皆带负电荷，在电场中向正极移动，因泳动速度不同而被分离。 【对应注意点】支持物的选择一定要综合各种因素，比如醋酸纤维素薄膜电泳可把血清蛋白质分离为蛋白Ａ，α１、α２、β和γ－球蛋白，将蛋白质染色后，可按染色取代位置进行定性观察，也可对各条色带进行定量测定。 【5】电压： 　　　电泳时，电压应控制在１１０～１４０Ｖ，不能过高。 　　　若电压太高，产热太高，产热量大，则蛋白质标本会破坏。 并且电压高则带点颗粒移动速度快，分离效果不理想。 【对应注意点】电泳时，电压应控制在１１０～１４０Ｖ，不能过高。 【６】其他因素：1.醋酸纤维膜在电泳前，一定要在缓冲溶液中浸泡，否则有碍 电泳分离，最好是浸泡过夜，效果最佳。 2.点样时样品一定要点在无光泽面，否则很难吸入，点样量 不宜过多。其原因是醋酸纤维素薄膜承受蛋白质有限。量过多则分子量相近的物质相互争夺迁移而重叠，影响结果观察。 3.电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必须进行，要先关闭电源