质粒电泳.docVIP

碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒： 共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋 开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子 线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子 溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖 5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0) 10mmol/L EDTA(PH8.0) 溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH 2% SDS 使用前新鲜配制 溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60 mL 冰醋酸11.5 mL 水28.5 mL RNase A酶：将粉末溶于10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L N