第四章-2 基因工程-课件.pptVIP

——目的基因的克隆与基因文库的构建 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 A 鸟枪法 特点 速度快； 成本较低； 简单易行； B 基因文库的构建 video 06基因文库的构建 C cDNA法 D PCR法 E 化学合成法 以T 细胞受体（T-cell receptor，TCR；有时亦称之为T细胞抗原受体）编码工因的分离为例子，说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。　　TCR基因只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。从T细胞mRNA制备来的单链cDNA，同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温，所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子（约占98%），都能与B细胞的mRNA退火形成DNA-RNA杂交分子，而不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA（约占2%），由于B细胞中没有相应的mRNA，仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱（hydroxylapatite column），于是DNA-RNA杂交杂分便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。如此回收入到的T细胞特异的cDNA被转变为双链cDNA之后，与适当的λ噬菌体载体重组并转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞持cDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备扣除的cDNA探针，即被B细胞mRNA杂交扣除了的T细胞特异的cDNA探针，筛选文库，结果成功地分离到了T细胞的TCR基因。　　扣除杂交法同样也可以用来分离缺失突变基因 . 根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（house-keeping），以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动；另一类叫做发育调控基因（developmental regulated gene），以其时空特异性表达模式完成个体的正常的生长、发育与分化。　　在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，叫做基因的差别表达（differential expression），生物的发育与分化、细胞的周期变化、生物体对外界环境压力反应，以及个体的衰老与死亡等所有的生命过程，都可归结于基因的差别表达 . mRNA差别显示的原理 几乎所有的真核基因mRNA分子的3′-端都有一段poly（A）序列，根据这种序列结构特征，P.Liang 等人设计合成了总共12种不同的下游引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫做3′-端锚定引物，它是由11个或12个连续的脱氧胸苷酸加上两个3′-端锚定脱氧核苷酸组成，并用5′-T11MN或5′-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。　　由于在这些cDNA群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的mRNA种的含量是相当低的，所以要把一种只在某一发育阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要通过PCR扩增. 在表达文库的筛选中，也是先将平板中的菌落或噬菌斑原位复印到硝酸纤维素滤膜上。如下图所示，当培养平板上的噬菌体发育成斑之后，每个斑中都含有大量的由噬菌体产生的融合蛋白质，在复印过程上它们便被转移到滤膜上。使用含有目标蛋白质的抗体（第一抗体）的溶液与滤膜混合保温。经过适当时间之后，抗体便同已经吸附在硝酸纤维素滤膜上的融合蛋白质紧密地结合起来。然后漂洗滤膜除去未结合的抗体，再加入第二抗体或葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA），继续与滤膜温育，第二抗体可以是放射性同位素标记的，也可以是同生物素偶合的，或是同某种酶（比如碱性磷酸酶）结合的。通过这些第二抗体同第一抗体间的结合作用，为我们提供了可观察的标记（如放射性标记），用以确定能够表达可被第一抗体特异性识别的目标蛋白质的阳性克隆的位置。最后，将放射性自显影X光底片和原初平板对照，挑取下阳性克隆，并从中分离重组噬菌体DNA进行测序鉴定。 也可以通过测定蛋白质的功能进行筛选，或用放射性同位素标记、带有特定蛋质结合位点的DNA片段作探针筛选cDNA表达文库，从中鉴定出能