实验三 对基苯甲酸酯类混合物的R-HPLC分析.doc

实验三、对羟基苯甲酸酯类混合物的RP-HPLC分析 一、实验目的 1. 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量； 2. 熟悉高效液相色谱分析操作。 3. 复习并掌握高效液相色谱的应用原理。 二、实验原理 在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯，它们都是强极性化合物，可采用反相高效液相色谱进行分析，选用非极性的C-18柱，甲醇和水按一定的配比做流动相。 由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。这种利用纯物质对照进行定性的方法，适宜来源已知且组分简单的混合物。 本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析相同： 对羟基苯甲酸酯类混合物属于同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相同的校正因子，故上式可简化为： 三、仪器与试剂 1. Agilent 1100 和Agilent 1200?高效液相色谱仪 2. 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯均为分析纯 3. 超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯 四、实验条件 1. 色谱柱（XDB-C18） 颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm 2. 流动相 甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 1 mL/min 3. 检测器 紫外光度检测器，254 nm 4. 进样量 10 uL 五、实验步骤 1. 将流动相甲醇和水分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min。 2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min。 3. 接通仪器和电脑电源，打开计算机，自动出现并运行Bootp Server程序（1200 LC 没有出现此界面）。 4. 从上到下依次打开 LC各模块电源。 5. 待各模块自检完成后，Bootp Server窗口显示6行仪器与计算机连接正常的信号后，（注意：Bootp Server程序窗口不能关），双击电脑桌面上的Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与LC通讯，进入工作站画面。 6. 单击工作站画面的On按钮，系统Pump打开，并根据上次实验设定的流速和流动相开始工作（一般此时流动相是纯甲醇）。 7. 打开仪器上的Purge valve，则系统开始Purge，单击Pump图标，将流速设到2 mL/min直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。然后将流速设为0.5 mL/min，再关闭Purge valve。 8. 单击Pump图标，进入Pump编辑画面，先用0.5 mL/min甲醇清洗仪器30 min，待仪器液路和电路系统达到平衡时，压力稳定，基线呈平直，再设定实验所需的流速和流动相。 9. 单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。 10. 点VWD 图标，设定实验所需波长。 11. 待设定参数后的仪器液路和电路系统达到平衡时，压力稳定，基线呈平直，将仪器调节至进样状态（Load位置），依次分别用专用的平头针头吸取10 uL的溶液进样并把进样阀扳到Inject位置。（每次进样前可在“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，输入操作者名称等信息，在“Data file ”中选择Prefix，并在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。） 12. 分析结束后，从Run control 菜单中选择最后一项，即停止进样分析，此时仪器自动记录并积分色谱图。 13. 打印色谱图。 14. 待所有样品分析完后，单击Pump图标，进入Pump编辑画面，准备清洗仪器，本实验用0.5 mL/min的甲醇清洗仪器30 min，若实验过程用到酸或缓冲盐做流动相，须先用0.5 mL/min水清洗仪器60 min，再用0.5 mL/min的甲醇清洗仪器30 min。 15. 当仪器冲洗干净后，单击工作站画面的Off按钮，关泵，退出化学工作站，关掉Bootp Server窗口，关闭计算机，最后从下往上关掉LC电源开关。再关总电源。 16. 实验结束后做好仪器使用情况登记，经实验指导老师签名后方可离开实验室。 六、思考题 1. 本实验为什么采用反相高效液相色谱，试说明理由。 2. 高效液相色谱分析中流动相及试样为什么都要过滤和脱气，不过滤和脱气对实验有何影响？