冬凌草甲素作用PI3K-AKT通路诱导HeLa细胞凋亡论文.docVIP

　　冬凌草甲素作用PI3K/AKT通路诱导HeLa细胞凋亡论文 沈宏伟， 胡红珍， 曾海涛， 柯佩琪， 杨越波， 李小毛， 任姿 【摘要】 【目的】研究冬凌草甲素诱导HeLa 细胞凋亡的作用及其机制。【方法】MTT 法测定冬凌草甲素对HeLa 细胞的生长抑制实验, Hoechst 33342荧光染色等观察细胞核形态学变化; LDH 法研究细胞死亡的途径。流式细胞仪检测细胞的凋亡，免疫印迹实验检测相关蛋白的表达。【结果】 25 μmol/L以上的冬凌草甲素对宫颈癌HeLa细胞具有明显的生长抑制作用,并能诱导细胞发生凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高, 冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中,细胞端粒酶Akt、FKHRL、GSK3表达水平及活性显著降低。【结论】 冬凌草甲素能够通过诱导人子宫颈癌HeLa 细胞发生凋亡而发挥抑制HeLa 细胞生长作用.freelechanism of action of oridonin, a diterpenoid isolated from Rabdosia rubescens, in human cervical carcinoma HeLa cell line. 【Methods】Morphological analysis, nuclear condensation, and fragmentation of chromatin onitored using Hoechst 33342 staining. Cell viability etric assay. Cell apoptosis and apoptosis-related proteins in HeLa cell line etry and I 1640 培养液于37 ℃、体积分数5%CO2 饱和湿度的细胞培养箱培养,实验使用细胞均为接种后24 h 处于对数生长期细胞。 1.2 诱导细胞凋亡的形态学观察及测量 将细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化,接种至24 孔板中,每孔含细胞数4 × 104 个,每孔0. 5 mL 的完全培养液中,置37 ℃、体积分数为5%的CO2 培养24 h ,更换新鲜培养基。加冬凌草甲素,使药物终浓度分别为0、10、20 mg/L ,继续培养48 h ,加50 g/L多聚甲醛(PBS, pH 7.2) 4 mL ,固定20 min。加入Hoechst 33342 ,使终浓度为5 mg/L,室温暗处静置,去上清液,加PBS (pH 7.2)洗2 次,在多功能倒置显微镜(Nikon TE300) 下观察, 并用Leica DC200 拍照。 1. 3 细胞生长率测定 采用MTT 法检测HeLa 细胞的生长率。取对数生长期细胞,用完全培养液调整细胞数为1×104个/ mL ,接种于96 孔板,24 h 后分别加入终浓度为: 2.5, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0 μmol/L的冬凌草甲素作用24 h,同时设置正常对照组(加实验组等体积培养液做对照) ,每组6 复孔，取药物作用24 h 后,每孔加入5 mg/ mL MTT 10 μL ,摇床混匀后,继续培养4 h ,每孔吸出100 μL 上清液,同时每孔加入DMSO(国产) 100 μL ,摇床混匀15 min ,室温静置20 min 后,在酶标仪(波长= 495 nm/ 530 nm ) 测A值,计算细胞生长率: 细胞生长率=（处理组/正常对照组）×100 %。并且采用上述方法检测25.0 μmol/L 的冬凌草甲素作用0，6，12，24 h后HeLa 细胞的细胞生长率。 1. 4 流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡率 将HeLa 细胞数按1×104/mL置于100 mL 培养瓶中,分对照组和药物组,药物组为25.0 μmol/L的冬凌草甲素,分别作用0，6，12，18，24 h后用于流式细胞仪检测，每组6 复孔。细胞凋亡检测:收集对照组和药物组各20 000个细胞，PBS 液洗涤,加入碘化丙啶( PI)工作液0.5 mL (浓度为10 μg/mL) (北京岳泰生物公司) ,室温避光30 min , FACScan流式细胞仪分析和处理数据。 1.5 A)室温作用4 h。漂洗3 次后加第二抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体)室温作用2 h,漂洗3次。加发光剂(Lumi GLO ),置感光盒中感光,显影,定影。实验重复3次。 1.6 统计处理 数据用ｘ±ｓ表示, 采用统计软件SPSS 10.0 进行数据处理, 组间数据采用t 检验或秩和检验。x 2 结 果 2. 1 冬凌草甲素诱导细胞凋亡的形态变化 在相差显微镜下,对照组细胞界限清晰,胞浆丰富,饱满;在荧光显微镜